一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合

實驗三新生大鼠大腦皮層混合細胞的培養(yǎng)和鑒定編輯ppt一、實驗目的

通過混合培養(yǎng)傳代的方法純化能得到星形膠質細胞，同時對其進行形態(tài)學的觀察和相關的免疫抗原反響鑒定，旨在建立比較成熟的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為后續(xù)實驗中提供穩(wěn)定的細胞來源。編輯ppt二、實驗材料、試劑與器材

1H-DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；小牛血清；N2Supplement；多聚賴氨酸、Hoechst33258、BrdU；羊抗鼠GFAP抗體、羊抗鼠BrdU抗體；FITC標記羊抗鼠二抗、PE標記的羊抗鼠二抗；FITC標記的羊抗鼠β-III-Tubulin抗體。2超凈工作臺；二氧化碳培養(yǎng)箱；低速臺式離心機；活細胞工作站；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)；倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)；電熱恒溫鼓風枯燥箱；電熱恒溫水槽；超聲波清洗機；立式壓力蒸汽滅菌器。編輯ppt三、實驗原理混合細胞培養(yǎng)時主要取材于SD大鼠大腦皮層，體外剝離腦膜后機械吹打分散成單細胞懸液接種在血清培養(yǎng)基中，因為原代培養(yǎng)過程是將體內(nèi)環(huán)境轉變成體外環(huán)境，只有一小局部細胞成活下來，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞開始成熟、分裂。原代培養(yǎng)約一周左右，細胞能長滿皿底，細胞生長狀態(tài)較好。胰酶消化原代培養(yǎng)的混合細胞并重新接種，大局部神經(jīng)元死亡，在含有血清的培養(yǎng)條件下不斷的傳代導致細胞種類單一化，即為星形膠質細胞。相對于神經(jīng)元的培養(yǎng)，神經(jīng)星形膠質細胞的培養(yǎng)要簡單，細胞對環(huán)境的變化要求較小。編輯ppt神經(jīng)膠質酸性蛋白〔GFAP〕是星形膠質細胞特異性胞內(nèi)抗原，而神經(jīng)細胞粘附分子〔NCAM〕是神經(jīng)類細胞〔包括神經(jīng)膠質細胞、神經(jīng)元以及神經(jīng)前體細胞〕外表特異性抗原；微管蛋白〔tubulin〕是組成神經(jīng)元骨架的重要組成成分和原始神經(jīng)上皮中所表達的最早的神經(jīng)元標志物之一，其中III型β微管蛋白〔β-III-tubulin〕作為神經(jīng)元特有標志物，被廣泛應用于神經(jīng)生物學研究中。本實驗利用GFAP、NCAM、β-III-tubulin分別對體外培養(yǎng)的星形膠質細胞和神經(jīng)元進行特異性抗原染色，鑒定細胞種類及純度。編輯ppt四、實驗步驟

取出生48h以內(nèi)的新生大鼠，75%酒精擦拭消毒后斷頭處死，剪開頭部皮膚，外撕，然后剪破顱骨，用眼科鑷沿大腦前方夾斷視神經(jīng)，小心取出大腦放于90mm塑料培養(yǎng)皿預冷的無菌Hank’s液中。在解剖顯微鏡下用腦科鑷分開左右半球，除去腦膜以及上面的血管，并除去大腦前方的嗅球和下方的下丘腦，將剝離腦膜的大腦皮層轉入另一含預冷Hank’s液的塑料培養(yǎng)皿中，清洗2-3次。將清洗后的大腦皮層轉到5ml離心管內(nèi)，參加預冷的Hank’s，巴氏吸管吹打，直至組織塊完全打散，液體成懸液狀。1000-1200r/min下離心10min左右。離心三次，最后一次將Hank’s換成DMEM。調(diào)整細胞密度〔約4×105/ml〕，將細胞接種在包被有0.01%PLL的75cm3細胞瓶內(nèi)〔培養(yǎng)基為H-DMEM+10%FBS+1%雙抗〕。37℃，5%CO2培養(yǎng)三天，第四天換液。以后每三天換液。編輯ppt【實驗結果與分析】SD大鼠大腦皮層神經(jīng)類細胞原代培養(yǎng)第三天時，培養(yǎng)皿底部有小局部細胞開始貼壁生長；換液后繼續(xù)培養(yǎng)約6d左右，細胞鋪滿皿底，并且出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，上層細胞形態(tài)比較單一，細胞呈二極或三極狀，主要為未成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)前體細胞；下層細胞呈鋪展狀，細胞較大，主要為星形膠質細胞。將混合培養(yǎng)長滿皿底的細胞胰酶消化后重新接種，得到第一代細胞，并反復按此方法將細胞按1：3進行反復傳代3-4次，因為在有血清條件下神經(jīng)元在體外存活時間較短且不能分裂，所以隨著細胞的傳代次數(shù)的增加，神經(jīng)元樣細胞越來越少，細胞形態(tài)也越來越單一，同時發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，細胞生長的速率越來越快。編輯ppt編輯ppt混合細胞的鑒定

將原代長滿以及傳至第四或第五代的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞進行GFAP和NCAM免疫化學染色，鑒定細胞種類及細胞純度。細胞吸出培養(yǎng)液后，0.01MPBS〔pH7.2〕洗兩次，每次5min。吸去PBS，參加4%多聚甲醛，4℃冰箱固定過夜。然后PBS洗三次，每次5min。滴加用PBS+NaN3〔0.02%〕+BSA〔3%〕+TritonX-100〔0.2%)稀釋的mouseanti-GFAPIgG(1：1000〕或者rabbitanti-NCAMIgG〔1：500〕，4℃冰箱過夜后PBS洗三次，每次5min，再參加FITC標記的山羊抗小鼠或者山羊抗兔二抗，室溫下作用45min。吸去二抗，PBS洗三次，每次5min，參加1μMHoechst33258室溫孵育5min，PBS洗兩次，共5min，最后50%緩沖甘油〔PBS配制〕封片，熒光顯微鏡下觀察陽性細胞。陰性對照采用PBS代替一抗或者二抗，結果陰性。編輯ppt【實驗結果與分析】分別對混合培養(yǎng)和不同傳代次數(shù)的細胞進行神經(jīng)膠質酸性蛋白〔GFAP〕和III型β微管蛋白〔β-III-Tubulin〕免疫熒光染色鑒定，從表一的結果可以看到，隨著傳代次數(shù)的增加，GFAP陽性細胞的比率在逐漸的提高，說明星形膠質細胞在不斷的純化。混合培養(yǎng)原代的免疫熒光結果顯示含有局部神經(jīng)元，同時在對P4代細胞的神經(jīng)細胞粘著分子〔NCAM〕和GFAP免疫抗原染色也發(fā)現(xiàn)存在少局部陰性細胞，可能是由于在別離腦膜時未去除干凈的少量成纖維細胞造成的。編輯ppt圖A：原代細胞GFAP免疫熒光鑒定；圖B：混合培養(yǎng)原代β-III-Tubulin免疫熒光鑒定;圖C：P4代