生物危害市公開(kāi)課一等獎(jiǎng)百校聯(lián)賽優(yōu)質(zhì)課金獎(jiǎng)名師賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件

第三章水產(chǎn)品生物危害檢驗(yàn)微生物檢驗(yàn)病毒檢驗(yàn)寄生蟲(chóng)檢驗(yàn)1/135第一節(jié)菌落總數(shù)一、菌落總數(shù)介紹：菌落是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成能被肉眼識(shí)別生長(zhǎng)物，它是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)相同細(xì)菌集合而成。菌落總數(shù)就是指在一定條件下每克（每毫升）檢樣所生長(zhǎng)出來(lái)細(xì)菌菌落總數(shù)。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求，即在需氧情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)。2/135放線菌霉菌3/135菌落總數(shù)≠實(shí)際活細(xì)菌數(shù)每個(gè)菌落可能是一個(gè)單獨(dú)細(xì)菌體，也可能是一群菌體所形成。厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求、非嗜中溫細(xì)菌，難以繁殖生長(zhǎng)。菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌種類(lèi)，所以有時(shí)被稱(chēng)為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

4/135菌落總數(shù)測(cè)定意義：菌落總數(shù)測(cè)定是用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反應(yīng)食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，方便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量?jī)?yōu)劣。5/135二、檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)方法參見(jiàn)：GB4789.2-94《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》GB/T4789.2-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定代GB/T4789.2-94SN0168-92《中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品菌落計(jì)數(shù)》6/135菌落總數(shù)測(cè)定，普通將被檢樣品制成幾個(gè)不一樣10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)48小時(shí)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平皿中形成菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每克（或每mL）原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)。7/135出口食品平板菌落計(jì)數(shù)

Platecountforbacterialcoloniesinfoodforexport（一）操作1.制備樣品均質(zhì)操作方法：以無(wú)菌操作取檢樣25g，放于225mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨制成1：10均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000－10000r/min速度處理1min，制成1：10均勻稀釋液?；静僮髌胀ò簶悠废♂?zhuān)瓋A注平皿－培養(yǎng)48小時(shí)－計(jì)數(shù)匯報(bào)。8/1352.樣品稀釋取10mL稀釋液，注入90mL緩沖液中制成稀釋樣品均液（1：100）。分別用10mL滅菌吸管，將稀釋樣品均液制成10倍遞增樣液。3.平皿接種選取適當(dāng)三個(gè)連續(xù)稀釋度樣品進(jìn)行平皿計(jì)數(shù)，1mL樣液與12-15mL培養(yǎng)基混合平板培養(yǎng)。每個(gè)稀釋度用2個(gè)平皿。4.培養(yǎng)瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，361℃恒溫培養(yǎng)482h。9/135（二）菌落計(jì)數(shù)方法普通計(jì)數(shù)規(guī)則25-250/平皿30-300/平皿蔓延生長(zhǎng)菌落鏈狀菌落瓊脂和平皿底之間形成水模樣菌落平皿邊緣或瓊脂表面形成水模樣菌落10/135（三）菌落數(shù)匯報(bào)每g（mL）樣品中平皿菌落數(shù)＝[(X1+X2)/2]×稀釋倍數(shù)/總克數(shù)(總體積)。只有在換算到每g（ml）樣品中平皿菌落數(shù)時(shí)，才能定下兩位有效數(shù)字。第三位數(shù)字采取四舍五入方法統(tǒng)計(jì)，也可統(tǒng)計(jì)為10指數(shù)形式11/135第二節(jié)大腸菌群、

糞大腸菌群和大腸桿菌

一大腸菌群定義需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌群細(xì)菌可包含大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。12/135衛(wèi)生學(xué)意義

大腸菌群分布較廣，多存在于溫血?jiǎng)游锛S便、人類(lèi)經(jīng)常活動(dòng)場(chǎng)所以及有糞便污染地方，故將大腸菌群作為食品被人和溫血?jiǎng)游锛S便污染指示菌來(lái)評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量。人、畜糞便對(duì)外界環(huán)境污染是大腸菌群在自然界存在主要原因。糞便中多以經(jīng)典大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其它型比較多。糞便是人類(lèi)腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者糞便，所以糞便內(nèi)除普通正常細(xì)菌外，同時(shí)也會(huì)有一些腸道致病菌存在（如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等。作為糞便污染指標(biāo)菌，大腸菌群數(shù)高低表明了糞便污染程度，潛伏著食物中毒和流行病威脅，也反應(yīng)了對(duì)人體健康危害性大小。13/135二糞大腸菌群和耐熱大腸菌群定義糞大腸菌群是人與溫血?jiǎng)游锬c道中數(shù)量最多桿菌，其基本形狀與大腸菌群相同，而且是總大腸菌群一部分。這類(lèi)菌群最大特點(diǎn)是能在43－45℃下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，主要指能夠發(fā)酵乳糖埃希氏菌屬。耐熱大腸菌群是指在紫紅膽鹽瓊脂上于44℃培養(yǎng)24h后形成直徑最少為0.5mm、繞有紅色沉淀環(huán)深紅色菌落細(xì)菌，如有需要可在含有乳糖液體培養(yǎng)基中44℃進(jìn)行產(chǎn)氣證實(shí)菌群。14/135起源定義適用食品NMKL北歐食品分析委員會(huì)No1253nded1996耐熱大腸菌群是指在紫紅膽鹽瓊脂上于44℃培養(yǎng)24h后形成直徑最少為0.5mm、繞有有一紅色沉淀環(huán)深紅色菌落細(xì)菌，如有需要可在含有乳糖液體培養(yǎng)基中44℃產(chǎn)氣證實(shí)除生魚(yú)和漁產(chǎn)品以外全部食品NMKLNo962nded1994在EC肉湯于44.5±0.2℃培養(yǎng)，24h內(nèi)產(chǎn)氣細(xì)菌新鮮和冷凍海產(chǎn)食品ISO9308-2：1990（E）能在液體乳糖培養(yǎng)基中35±0.5℃或37±0.5℃培養(yǎng)，48h內(nèi)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44±0.25℃或44.5±0.25℃培養(yǎng)24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣細(xì)菌水（MPN法）ISO9308-2：1990（E）能在液體乳糖培養(yǎng)基中35±0.5℃或37±0.5℃培養(yǎng)，48h內(nèi)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44±0.25℃或44.5±0.25℃培養(yǎng)24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣細(xì)菌水（膜過(guò)濾法）15/135項(xiàng)目依據(jù)定義耐熱大腸菌群NMKLISO在44.5℃培養(yǎng)，24h天內(nèi)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣細(xì)菌糞大腸菌群NMKL在胰蛋白胨肉湯中于44.5℃，24h內(nèi)產(chǎn)生吲哚耐熱大腸菌群AOAC于LST中36℃培養(yǎng)48h內(nèi)產(chǎn)氣，并于EC內(nèi)培養(yǎng)44℃24h產(chǎn)氣一群細(xì)菌16/135衛(wèi)生學(xué)意義作為糞便污染指示菌，耐熱大腸菌群與大腸菌群、大腸桿菌相同，主要以其檢出情況來(lái)判斷，食品是否受到了糞便污染。通常情況下，耐熱大腸菌群與大腸菌群相比，在人和動(dòng)物糞便中所占百分比較大，而且因?yàn)樵谧匀唤缰休p易死亡等原因，耐熱大腸菌群存在，可認(rèn)為食品直接或間接受到了比較近期糞便污染。耐熱大腸菌群在食品中檢出，與大腸菌群相比，說(shuō)明食品受到了更為不清潔加工，腸道致病菌和食物中毒存在可能性更大。耐熱大腸菌群更能貼切地反應(yīng)食品受到人和動(dòng)物糞便污染程度，且檢驗(yàn)方法比大腸桿菌簡(jiǎn)單得多，應(yīng)備受重視。17/135三.大腸桿菌定義：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）是腸桿菌科，埃希氏菌屬，大腸桿菌株ATCC11775是該屬模式菌種。與人類(lèi)疾病相關(guān)大腸桿菌，統(tǒng)稱(chēng)為致瀉性大腸桿菌，普通包含五種：即腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）和粘附性大腸桿菌（EAEC）。18/135生物學(xué)特征：基本形態(tài)特征：革蘭氏染色陰性，不形成芽胞，有鞭毛能運(yùn)動(dòng)（約有50%左右菌株含有周生鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，但多數(shù)菌體只有1-4根，普通不超出10根），兩端鈍圓短小桿菌。普通大小約0.5um-0.8um×1.0um-3.0um。在441℃，242h內(nèi)能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。19/135在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)表現(xiàn)3種菌落形態(tài)：光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、光滑、呈灰色，在生理鹽水中輕易分散。粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝。粘液型：常為含有莢膜菌株。此菌兼性厭氧，在有氧條件下生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)pH為6.8-8.0，所用培養(yǎng)基pH為7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0則生長(zhǎng)遲緩。20/135大腸桿菌抵抗力：此菌對(duì)理化原因抵抗力，在無(wú)芽胞菌中是最強(qiáng)一個(gè)，在室溫可存活數(shù)周，在土壤、水中存活數(shù)月。耐寒力強(qiáng)，不過(guò)在30分鐘內(nèi)快速冷凍，將37℃降至4℃過(guò)程，可殺死此菌。加熱60℃，30分鐘，此菌可滅活。對(duì)漂白粉，酚、甲醛等較敏感，水中1ppb氯可殺死此菌。耐膽鹽，在一定程度上能抵抗煌綠等染料抑菌作用，在選擇性培養(yǎng)基配制上，常利用這一性質(zhì)。21/135衛(wèi)生學(xué)意義一旦檢出大腸桿菌，即意味著直接或間接地被糞便污染，而在衛(wèi)生學(xué)上被用于飲水，牛奶或食品等糞源性污染衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)因?yàn)榇竽c桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道病原菌相近，它出現(xiàn)也可能預(yù)示著一些腸道病原菌（例：沙門(mén)氏菌、志賀氏菌）存在，所以該細(xì)菌是國(guó)際上公認(rèn)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌最近，有些國(guó)家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染情況監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果評(píng)定指標(biāo)22/135SN0169-92出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法SN0333-94出口食品中大腸桿菌(葡萄糖苷酶熒光)檢驗(yàn)方法GB/T4789.32-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群快速檢測(cè)

四檢驗(yàn)23/135大腸桿菌檢驗(yàn)

1將EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h,取其產(chǎn)氣管培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)(EMB)平板,36±1℃培養(yǎng)24±2h。檢驗(yàn)平板上有沒(méi)有具黑色中心有光澤或無(wú)光澤經(jīng)典菌落。2如有經(jīng)典菌落,則從每個(gè)平板上最少挑取2個(gè)經(jīng)典菌落；如無(wú)經(jīng)典菌落,則從每個(gè)平板上最少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1℃培養(yǎng)18~24h。

24/1353.生化試驗(yàn)：將斜面培養(yǎng)物移種到以下培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。(1)色氨酸肉湯：在36±1℃培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。(2)MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃培養(yǎng)48±2h。以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。

將MR-VP培養(yǎng)物剩下部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性,若變黃色則為陰性反應(yīng)。25/135(3)Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養(yǎng)96h統(tǒng)計(jì)有沒(méi)有生長(zhǎng)。(4)LST肉湯：于36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。(5)革蘭氏染色：取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

26/135━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━

靛基質(zhì)┃MR┃VP┃枸椽酸鹽┃判定(型別)

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＋┃＋┃－┃－┃經(jīng)典大腸桿菌

－┃＋┃－┃－┃非經(jīng)典大腸桿菌

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＋┃＋┃－┃＋┃經(jīng)典中間型

－┃＋┃－┃＋┃非經(jīng)典中間型

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－┃－┃＋┃＋┃經(jīng)典產(chǎn)氣腸桿菌

＋┃－┃＋┃＋┃非經(jīng)典產(chǎn)氣腸桿菌

━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━結(jié)果匯報(bào)：大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC試驗(yàn)為＋＋－－或－＋－－,再依據(jù)LST肉湯陽(yáng)性管數(shù)查MPN表,匯報(bào)每克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值27/135檢樣（適宜三個(gè)連續(xù)稀釋樣品），接種LST肉湯↓37℃，48hLST肉湯管陽(yáng)性（疑似大腸菌群）↓↓EC肉湯BGLB肉湯管陽(yáng)性（證實(shí)大腸菌群）↓44℃，24h按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，匯報(bào)大腸菌群EC肉湯產(chǎn)氣管為陽(yáng)性（糞大腸菌群）查MPN表，匯報(bào)糞大腸菌群MPN/g陽(yáng)性管再培養(yǎng)24h,EMB平板分離↓37℃，24h黑色菌落移種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面LST肉湯I(xiàn)MViC生化試驗(yàn)革蘭氏染色產(chǎn)酸產(chǎn)氣++--/-+--無(wú)芽胞G-桿菌－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－大腸桿菌按EC肉湯產(chǎn)氣管數(shù)查MPN表，匯報(bào)大腸桿菌MPN/g28/135國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。大腸菌群最近似值是指100g或100mL食品中大腸菌群可能數(shù)29/135注意1．MPN檢索表：最大可能數(shù)(MostProbableNumber)簡(jiǎn)稱(chēng)。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋?zhuān)尤肱囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從要求反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不一樣稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)對(duì)應(yīng)降低或增加10倍。注意國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附MPN表所用稀釋度是不一樣，而且結(jié)果匯報(bào)單位也不相同。30/1352．初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：不論是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)基配制略有不一樣，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能必定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。31/1353．產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)常能夠看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)能夠碰到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮小氣泡。假如對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，能夠用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作深入試驗(yàn)。32/1354．挑選菌落：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，需要對(duì)初發(fā)酵陽(yáng)性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離，對(duì)經(jīng)典和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。因?yàn)榇竽c菌群是一群細(xì)菌總稱(chēng)，在平板大腸菌群菌落色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群檢出率親密相關(guān)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。挑取菌落數(shù)與大腸菌群檢出率有親密關(guān)系，只挑取一個(gè)菌落，因?yàn)闄C(jī)率問(wèn)題，尤其當(dāng)菌落不經(jīng)典時(shí)，極難防止假陰性出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取經(jīng)典菌落，如無(wú)經(jīng)典菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。33/135

5．抑菌劑：大腸菌群檢驗(yàn)中慣用抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑主要作用是抑制其它雜菌，尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌生長(zhǎng)和挑選，但對(duì)大腸菌群中一些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱(chēng)量時(shí)稍有誤差，即可對(duì)抑菌作用產(chǎn)生影響，所以抑菌劑添加應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。34/135出口食品中大腸桿菌（葡萄糖苷酶熒光）檢驗(yàn)方法TheLST-MUGassayisbasedontheenzymaticactivityof-glucuronidase(GUD),whichcleavesthesubstrate4-methylumbelliferyl-D-glucuronide(MUG),torelease4-methylumbelliferone(MU).Whenexposedtolongwave(365nm)UVlight,MUexhibitsabluishfluorescencethatiseasilyvisualizedinthemediumoraroundthecolonies.35/135糞大腸菌群測(cè)定1.用直徑為3mm接種環(huán)將全部48±2h內(nèi)產(chǎn)氣LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。2.將全部接種EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內(nèi),培養(yǎng)24±2h。水浴箱水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面。應(yīng)以已知為44.5℃產(chǎn)氣陽(yáng)性大腸桿菌和44.5℃不產(chǎn)氣產(chǎn)氣腸桿菌或其它大腸菌群細(xì)菌作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。3.統(tǒng)計(jì)EC肉湯管產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陰性。4.結(jié)果匯報(bào)：按產(chǎn)氣管數(shù),查MPN表匯報(bào)每克(毫升)樣品中糞大腸菌群MPN值。

36/135第三節(jié)

金黃色葡萄球菌及檢驗(yàn)

Staphylococcusaureus

37/135一.金黃色葡萄球菌生物學(xué)特征經(jīng)典金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無(wú)芽胞、無(wú)鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜。革蘭氏染色陽(yáng)性。38/135培養(yǎng)特征金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37℃，最適生長(zhǎng)pH7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板菌落周?chē)纬赏该魅苎h(huán)。金黃色葡萄球菌有高度耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)。39/135生化特征：分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，VP反應(yīng)弱陽(yáng)性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌含有較強(qiáng)抵抗力，對(duì)磺胺類(lèi)藥品敏感性低，但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。40/135二.金黃色葡萄球菌致病性金黃色葡萄球菌是人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)病原菌，可引發(fā)局部化膿感染，也可引發(fā)肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。41/135金黃色葡萄球菌致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生毒素和侵襲性酶：a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引發(fā)肌體局部缺血和壞死；b.殺白細(xì)胞素：可破壞人白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，妨礙吞噬細(xì)胞吞噬作用。葡萄球菌形成感染易局部化與此酶相關(guān)d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來(lái)作為依據(jù)判定金黃色葡萄球菌；e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引發(fā)急性胃腸炎蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E及F五種血清型。42/135當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時(shí)，經(jīng)8-10小時(shí)即可相當(dāng)數(shù)量腸毒素。腸毒素可耐受100℃煮沸30分鐘而不被破壞,它引發(fā)食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉。另外，金黃色葡萄球菌還產(chǎn)生溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。43/135三.金黃色葡萄球菌流行病學(xué)金黃色葡萄球菌在自然界中無(wú)處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物排泄物中都可找到。作為人和動(dòng)物常見(jiàn)病原菌，其主要存在于人和動(dòng)物鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康人皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染機(jī)會(huì)很多。美國(guó)疾病控制中心匯報(bào)，由金黃色葡萄球菌引發(fā)感染占第二位，僅次于大腸桿菌。44/135金黃色葡萄球菌流行病學(xué)普通有以下特點(diǎn)季節(jié)分布，多見(jiàn)于春夏季；中毒食品種類(lèi)多，如奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品。另外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引發(fā)中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。金黃色葡萄球菌可經(jīng)過(guò)以下路徑污染食品：食品加工人員、炊事員或銷(xiāo)售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過(guò)程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引發(fā)食物中毒；熟食制品包裝不嚴(yán)，運(yùn)輸過(guò)程受到污染；奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r(shí)，對(duì)肉體其它部位污染。45/135金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問(wèn)題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引發(fā)食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒33%，加拿大則更多，占45%，我國(guó)每年發(fā)生這類(lèi)中毒事件也非常多。腸毒素形成條件：存放溫度，在37℃內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時(shí)間越短；存放地點(diǎn)，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素；食物種類(lèi)，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時(shí)含一定量淀粉食物，腸毒素易生成。46/135四金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)參考檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：SN0172-92出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法GB/T4789.10-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

47/135基本原理

依據(jù)金黃色葡萄球菌特有形態(tài)以及培養(yǎng)特征，應(yīng)用BairdParker平板進(jìn)行分離。該平板中氯化鋰可抑制革蘭陰性細(xì)菌生長(zhǎng)，丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，以提升檢出率，并利用分解甘露醇和血漿凝固酶等特征，加以判別。

48/1357.5%氯化鈉肉湯蛋白胨10g

,氯化鈉75g,牛肉膏3g,蒸餾水1000mL,將上述成份加熱溶解，調(diào)pH值為7.4，分裝，121℃15min高壓滅菌。血瓊脂培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂100mL,脫纖維羊血（或兔血）10mL

將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱溶化，待冷至50℃左右以無(wú)菌操作加入脫纖維羊血（或兔血），搖勻，制成平板。置冰箱內(nèi)保留備用49/135BairdParker平板

胰蛋白胨10g,氯化鋰（LiC1·6H2O）5g,牛肉膏5g,

瓊脂20g,酵母浸膏1g,蒸餾水950mL,丙酮酸鈉10g

pH值7.0±0.2,甘氨酸12g.

增菌劑配置：將30%卵黃鹽水50mL與除菌過(guò)濾1%亞碲酸鉀10mL混合，保留于冰箱內(nèi)備用。

將各成份加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH值。分裝每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，每95mL加入預(yù)熱至50℃卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超出48h。

50/1351．金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)樣品處理：無(wú)菌取25g或25mL食品樣品，放入225mL滅菌生理鹽水中均質(zhì)，制成10-1稀釋液。增菌培養(yǎng)：將10-1稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。分離培養(yǎng)：將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。51/135

Baird-Parker平板在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周?chē)幸粶啙釒А?/p>

BloodAgar平板金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周?chē)腥苎Α?2/135染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進(jìn)行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無(wú)芽胞、莢膜，直徑0.5-1μm。53/1352.血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn)是區(qū)分致病性葡萄球菌與非致病葡萄球菌最主要指標(biāo)。致病性葡萄球能產(chǎn)生血漿凝固酶，此酶作用類(lèi)似凝血酶原，在血漿中激活劑作用下，可使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，從而造成血漿凝固（展現(xiàn)塊狀或顆粒狀）。非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生此酶，因而不能凝固血漿。此酶有兩種存在形式：結(jié)合于細(xì)胞壁上血漿凝固酶，采取玻片法測(cè)；游離形式血漿凝固酶，采取試管法檢測(cè)。54/135玻片法

取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴滅菌生理鹽水，另一端滴加一滴血漿，用接種環(huán)挑取待檢菌落，分別在生理鹽水及血漿中充分研磨混合。血漿與菌苔混懸液在5min內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊時(shí)，而鹽水滴仍呈均勻渾濁且無(wú)凝固現(xiàn)象者為陽(yáng)性.如二者均無(wú)凝固現(xiàn)象則為陰性。凡玻片試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)或鹽水滴與血漿滴都有凝固現(xiàn)象，再進(jìn)行試管凝固酶試驗(yàn)。

55/135血漿凝固酶試驗(yàn)（Coagulase

test）取1:4新鮮血漿0.5mL,加肉湯培養(yǎng)物0.3mL于試管內(nèi)充分混合,置36±1℃培養(yǎng),每隔半小時(shí)觀察是否有凝塊形成,最少觀察6h,以?xún)?nèi)容物完全凝固,使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽(yáng)性。試驗(yàn)中需同時(shí)做巳知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。56/135耐熱核酸酶試驗(yàn)：將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，36±1℃培養(yǎng)24小時(shí)，在刺種線周?chē)霈F(xiàn)淡粉色者為陽(yáng)性。本試驗(yàn)金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性。57/1353.直接計(jì)數(shù)方法(1)吸收上述10-1混懸液，進(jìn)行十倍遞次稀釋?zhuān)罁?jù)樣品污染情況，選擇不一樣濃度稀釋液1mL，分別加入三塊Baird-Parker平板，每個(gè)平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌棒涂布整個(gè)平板。如水分不被吸收，可將平板放在36±1℃溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36±1℃溫箱培養(yǎng)。0.30.30.458/135(2)在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周?chē)谢鞚釒Ш谏?，并從中任選5個(gè)菌落，分別接種血平板，36±1℃24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。(3)菌落計(jì)數(shù)：將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。59/1354.葡萄球菌食物中毒診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)一、動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)：主要用幼貓和猴。二、血清學(xué)試驗(yàn)：對(duì)應(yīng)抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)沉淀、凝集現(xiàn)象。腸毒素作為抗原，能夠和特異性抗體發(fā)生結(jié)合性反應(yīng)，產(chǎn)生可見(jiàn)沉淀。免疫瓊脂擴(kuò)散法反向間接血凝試驗(yàn)免疫熒光法酶聯(lián)免疫吸附法

60/1351.動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)?zāi)c毒素制備

將分離菌株肉湯培養(yǎng)物1-2mL，加入杜爾曼培養(yǎng)基上，使菌液平鋪于培養(yǎng)基表面(平皿不能倒置)，置37℃10%CO2(密閉缸燃燭法)中培養(yǎng)72h.培養(yǎng)基中加入無(wú)菌生理鹽水10mL，搗碎瓊脂使成糜粥狀，離心8000r/min30min，取上清液置沸水浴中煮沸30min.注射前準(zhǔn)備先給幼貓喂少許食物，方便觀察嘔吐反應(yīng)61/135動(dòng)物接種和觀察取上清液按幼貓?bào)w重(生后約6-8周）1mL/100g量，注射于腹腔內(nèi)，在注射后4h如有惡心、嘔吐、腹瀉、體溫上升或死亡等現(xiàn)象，同時(shí)以未接種菌培養(yǎng)基上清液接種幼貓作為對(duì)照。若對(duì)照貓陰性，而試驗(yàn)貓出現(xiàn)反應(yīng)，即為腸毒素陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)

如發(fā)生爭(zhēng)吵時(shí)以微玻片法為依據(jù)。62/1352血清學(xué)方法

1.菌株提取腸毒素方法液體透析培養(yǎng)法將寬2.5cm、長(zhǎng)80cm透析袋內(nèi)裝入60mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基，兩端系緊，將透析袋裝入250mL三角瓶?jī)?nèi)，加入15mL滅菌生理鹽水。透析袋兩端留在瓶口，用棉塞塞好，高壓滅菌103.43kPa30min。待測(cè)菌株接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面(試管18mm×180mm)，37℃培養(yǎng)24h，用生理鹽水5mL洗下菌苔，傾入上述培養(yǎng)瓶中，每個(gè)菌株種一瓶，37℃振蕩培養(yǎng)48h，振速100次/min。63/135吸出菌液離心8000r/min30min。取上清液加熱100℃10min，再離心，8000r/min15min。取上清液做雙相瓊脂擴(kuò)散。64/135B固體透析培養(yǎng)法

直徑150mm無(wú)菌平皿傾入滅菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，凝固后表面鋪一無(wú)菌玻璃紙。接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂菌株，放37℃培養(yǎng)24h，用約3mL滅菌鹽水，洗下菌苔，傾在玻璃紙上，用滅菌三角棒涂滿滅菌平皿，37℃培養(yǎng).加10-20mL滅菌生理鹽水，用三角棒刮取菌苔，吸出菌液8000r/min30min離心，取上清液做雙相瓊脂擴(kuò)散。65/1353.雙相瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)腸毒素(1)微玻片法

將在95%酒精中浸泡載玻片，用潔凈紗布擦干，吸收溶化0.2%瓊脂糖滴在載玻片上，使剩下瓊脂糖流下，放入無(wú)塵環(huán)境中干燥。先將一層薄塑料板放在載玻片上，然后將帶孔塑料膜板邊緣涂一層薄硅膠或凡士林，放在塑料板上，兩邊用橡皮圈系緊固定.66/135吸收1%瓊脂糖，馬上從模板中間孔加入載玻片和膜板之間，直至充滿瓊脂糖。凝固后在中間孔滴加抗血清，四面滴加菌株產(chǎn)毒液或被檢液，放入加有濕棉球平皿內(nèi)，放25-30℃、18-24h觀察結(jié)果?？稍跓艄馍?，并對(duì)著暗背景觀察，在抗體血清和提取液之間展現(xiàn)顯著沉淀線。如沉淀線只能微弱可見(jiàn)時(shí)，可進(jìn)行染色。67/13568/135(2)玻片法

吸收溶化1%瓊脂糖2.5mL，鋪在潔凈載玻片上，凝固后用直徑2.5mm金屬打孔器打成輻射型，孔距為2.5mm，中心孔加入腸毒素抗血清，周?chē)鶄€(gè)加入菌株或食品提取液。載玻片放平皿內(nèi)，再放一塊滴有三氮化鈉濕棉球以保持平皿內(nèi)濕度，置25-30℃、18-20h觀察結(jié)果，在血清和提取物之間有顯著沉淀線即為陽(yáng)性。

69/135(3)染色方法：取下膠帶和塑料模板，將玻片放在蒸餾水中浸泡約4-8h。在100mL1%乙酸中加入100mg噻嗪紅R(或氨基黑B)。1%乙酸、1%甘油、1%乙酸三種溶液依次浸泡10min，如脫色不凈，可繼續(xù)浸泡。排除多出液體，在室溫或35℃溫箱烘干，沉淀線被染成染料顏色。70/135五金黃色葡萄球菌控制1）預(yù)防金黃色葡萄球菌污染食品預(yù)防帶菌人群對(duì)各種食物污染：定時(shí)對(duì)生產(chǎn)加工人員進(jìn)行健康檢驗(yàn)，患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等）人員要暫時(shí)停頓其工作或調(diào)換崗位。對(duì)肉制品加工廠，患局部化膿感染禽、畜尸體應(yīng)除去病變部位，經(jīng)高溫或其它適當(dāng)方式處理后進(jìn)行加工生產(chǎn)。71/1352）預(yù)防金黃色葡萄球菌腸毒素生成應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好條件下貯藏食物，以防腸毒素形成；在氣溫高春夏季，食物置冷藏或通風(fēng)陰涼地方也不應(yīng)超出6小時(shí)，而且食用前要徹底加熱。72/135金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法（介紹）當(dāng)前，伴隨研究深入，一些快速和采取當(dāng)代技術(shù)檢測(cè)方法不停出現(xiàn)，這些新快速方法，普通都縮短了傳統(tǒng)檢測(cè)方法時(shí)間，能夠較快地得到檢測(cè)結(jié)果，而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單。比如：法國(guó)梅里埃企業(yè)生產(chǎn)RPF試劑盒、API檢測(cè)系統(tǒng)等。梅里埃企業(yè)生產(chǎn)miniVIDAS利用熒光免疫方法檢測(cè)葡萄球菌腸毒素，在儀器上45分鐘能夠得到結(jié)果。比如：美國(guó)3M企業(yè)生產(chǎn)金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)試片，能夠直接計(jì)數(shù)產(chǎn)生耐熱核酸酶金黃色葡萄球菌，操作簡(jiǎn)單，縮短了時(shí)間。73/135第四節(jié)單核增生李斯特氏菌Listeriamonocytogenes

74/135單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一個(gè)人畜共患病病原菌。它能引發(fā)人畜李氏桿菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在單增李氏菌對(duì)人類(lèi)安全含有危險(xiǎn)，該菌在4℃環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類(lèi)健康主要病原菌之一，所以，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。75/135一、生物學(xué)特征1、形態(tài)與染色該菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小約為0.5μm-2.0μm,直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀.兼性厭氧、無(wú)芽胞，普通不形成莢膜，但在營(yíng)養(yǎng)豐富環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。76/1352、培養(yǎng)特征該菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在20-25℃培養(yǎng)有動(dòng)力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見(jiàn)倒立傘狀生長(zhǎng)，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見(jiàn)翻跟斗運(yùn)動(dòng)。該菌生長(zhǎng)范圍為2-42℃（也有報(bào)道在0℃能遲緩生長(zhǎng)）。最適培養(yǎng)溫度為35-37℃，在pH中性至弱堿性（pH9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高條件下該菌生長(zhǎng)良好。在6.5%NaCl肉湯中生長(zhǎng)良好。在pH3.8-4.4能遲緩生長(zhǎng)。77/135在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但伴隨菌落增大，變得不透明。在5-7%血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小β-溶血環(huán)。單增李斯特氏菌在海博李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上

37℃培養(yǎng)24-28小時(shí)，平板上出現(xiàn)藍(lán)色菌落，菌落周?chē)幸徊煌该鳝h(huán)。在海博李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上

78/1353、生化反應(yīng)該菌觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性.能發(fā)酵各種糖類(lèi)，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖，不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗(yàn)和精氨酸水解陽(yáng)性。79/1354、血清型依據(jù)菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個(gè)血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”13個(gè)血清型。致病菌株血清型普通為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b，后兩型尤多。80/1355、抵抗力該菌對(duì)理化原因抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青儲(chǔ)飼料和干草內(nèi)能長(zhǎng)久存活，對(duì)堿和鹽抵抗力強(qiáng)。60-70℃經(jīng)5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌。該菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、磺胺均敏感。81/135二、流行病學(xué)李斯特氏菌(Listeria)是條件致病菌，大多為散發(fā)病例，也可因污染食品而暴發(fā)。它能產(chǎn)生一個(gè)溶血素性質(zhì)外毒素。能引發(fā)人和牛、綿羊等動(dòng)物腦膜炎，可使家兔豚鼠等試驗(yàn)動(dòng)物感染引發(fā)血中單核細(xì)胞增高。該菌可經(jīng)過(guò)眼及破損皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)而造成感染。孕婦感染后經(jīng)過(guò)胎盤(pán)或產(chǎn)道感染胎兒或新生兒，可引發(fā)嬰兒及新生兒化膿性腦膜炎或腦膜腦炎，死亡率可達(dá)70%。子宮內(nèi)感染新生兒可造成新生兒李斯特氏菌病、流產(chǎn)、死胎或習(xí)慣性流產(chǎn)。82/135單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲(chǔ)飼料、爛菜中都有該菌存在，所以動(dòng)物很輕易食入該菌，并經(jīng)過(guò)口腔-糞便路徑進(jìn)行傳輸。據(jù)報(bào)道，健康人糞便中單增李氏菌攜帶率為0.6-16%，有70%人可短期帶菌，4-8%水產(chǎn)品、5-10%奶及其產(chǎn)品、30%以上肉制品及15%以上家禽均被該菌污染。人主要經(jīng)過(guò)食入軟奶酪、未充分加熱雞肉、未再次加熱熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約占85-90%病例是由被污染食品引發(fā)。83/1351981年加拿大沿海發(fā)生李斯特氏菌暴發(fā)性流行經(jīng)證實(shí)是因?yàn)槔钏固厥暇廴揪硇牟松隆?983年6月在美國(guó)馬薩諸塞州發(fā)生李斯特氏菌中毒，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)覺(jué)是因?yàn)轱嬘昧撕欣钏固厥暇褪舷灸?，調(diào)查結(jié)果表明為存在于患病奶牛所產(chǎn)奶中細(xì)胞內(nèi)部李斯特氏菌有很強(qiáng)耐熱力所致。84/135三、致病性單增李氏菌進(jìn)入人體后是否發(fā)病，與菌毒力和宿主年紀(jì)、免疫狀態(tài)相關(guān)，因?yàn)樵摼且粋€(gè)細(xì)胞內(nèi)寄生菌，宿主對(duì)它去除主要靠細(xì)胞免疫功效。易感者為新生兒、孕婦及40歲以上成人。另外，酗酒者、免疫系統(tǒng)損傷或缺點(diǎn)者、接收免疫抑制劑和皮質(zhì)激素治療患者及器官移植者也易被該菌感染。該病臨床表現(xiàn)，健康成人個(gè)體出現(xiàn)輕微類(lèi)似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺點(diǎn)患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)燒、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥直至死亡。85/135SN0184-93出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法

SN/T0184.4-進(jìn)出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌氏檢測(cè)方法

GB/T4789.30-食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)四、檢驗(yàn)和控制86/135（一）檢驗(yàn)冷凍樣品，2－5℃解凍，不超出18h

若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于－15℃保留

非冷凍易腐樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)

若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于4℃冰箱保留，在24h之內(nèi)檢驗(yàn)87/1351、增菌培養(yǎng)無(wú)菌取樣品25g(mL)放入滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中加225mLFB1增菌液，充分均質(zhì)，30℃培養(yǎng)24-26h。吸收1mL加入10mLFB2增菌液中30℃二次增菌24-26h2、分離選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)取增菌液一環(huán)，劃線分離于選擇性培養(yǎng)基OXA、PALCAM瓊脂平板上，34-36℃培養(yǎng)24h-48h。黑色菌落觀察88/135李斯特氏菌在牛津瓊脂（OXA瓊脂平板）35℃培養(yǎng)24-48小時(shí)后，灰綠色菌落。其外圍有一黑色環(huán)。蛋白胨提供氮源和氨基酸，可溶性淀粉消除一些毒性物質(zhì)，氯化鈉維持滲透壓，瓊脂是凝固劑，氯化鋰抑制革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)，混合抗菌劑抑制除李氏菌外革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，李氏菌分解七葉苷與鐵離子結(jié)合形成黑色菌落，并在菌落周?chē)纬勺厣h(huán)。成份(g/L)特殊蛋白胨23.0可溶性淀粉1.0氯化鈉5.0瓊脂13.0七葉苷1.0檸檬酸鐵銨0.5氯化鋰15.0,25℃pH7.0±0.289/135

李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在OXA瓊脂平板上菌落相同。在OXA和PALCAM瓊脂平板上挑取5個(gè)或更多可疑菌落，接種于TSA－YE瓊脂平板上，純培養(yǎng)后進(jìn)行判定。90/1353判定步驟（1）藍(lán)色菌落檢驗(yàn)：用45?斜射光照射胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)平板觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。用標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽(yáng)性對(duì)照。將純化后菌落接種于TSA-YE肉湯，35℃培養(yǎng)24h，供生化等項(xiàng)目檢驗(yàn)使用。胰蛋白胨

15.5g

大豆蛋白胨

5.0g

,NaCl

5.0g

酵母膏

6.5g

,瓊脂

15.0g

蒸餾水

1000ml

91/13592/135（2）經(jīng)典運(yùn)動(dòng)鏡檢從30℃或更低溫度下挑取經(jīng)典菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。假如菌量太少，菌體黏附于載玻片上而展現(xiàn)非運(yùn)動(dòng)性。李斯特氏菌是細(xì)短桿菌，可見(jiàn)輕微旋轉(zhuǎn)及翻滾。與已知李斯特氏菌對(duì)攝影比，球形、大桿狀且快速泳動(dòng)都不是李斯特氏菌。93/135（3）革蘭氏染色取16-24h培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽(yáng)性桿菌。不過(guò)陳舊培養(yǎng)物革蘭氏染色會(huì)發(fā)生改變，而且菌體可成球形。在染色過(guò)重玻片上菌體有呈柵狀排列趨勢(shì)，易誤認(rèn)為白喉菌而錯(cuò)判。94/135（4）過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)：挑取經(jīng)典菌落進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，李斯特氏菌呈過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)。挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán),置于潔凈試管內(nèi),滴加3%過(guò)氧化氫溶液2mL,觀察，于半分鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性,不發(fā)生氣泡者為陰性。95/135（5）溶血試驗(yàn)在TSAYE平板上挑取經(jīng)典菌落刺種到7%羊血瓊脂平板上，刺種時(shí)防止觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對(duì)照（英諾克李斯特氏菌），30℃培養(yǎng)24-48h。在明亮光照下，觀察經(jīng)穿刺血瓊脂平板，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點(diǎn)產(chǎn)生較清楚β-溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，而綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生界限顯著較大溶血環(huán)。96/13597/135（6）動(dòng)力試驗(yàn)將TSA-YE肉湯培養(yǎng)物穿刺接種于SIM半固體培養(yǎng)基，于室溫（20－25）培養(yǎng)48h。李斯特氏菌有動(dòng)力，在半固體試管內(nèi)呈經(jīng)典傘狀生長(zhǎng)98/135（7）硝酸鹽還原試驗(yàn)：用TSB-YE肉湯培養(yǎng)物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培養(yǎng)5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合。假如在1min-2min內(nèi)出現(xiàn)紫紅色為陽(yáng)性反應(yīng)，表明硝酸鹽已被還原。如無(wú)顏色出現(xiàn)，在試管內(nèi)再加入少許鋅粉，放置1h，如出現(xiàn)紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細(xì)菌還原，判斷為陰性。99/135（8）MR－VP試驗(yàn)將TSB－YE肉湯培養(yǎng)物接種于MR-VP肉湯中，于35℃培養(yǎng)48h。移取1ml培養(yǎng)物于潔凈試管中，加5％萘酚溶液0.5ml，再加4％氫氧化鉀0.2ml，輕輕搖動(dòng)試管約1min，靜置約20min。出現(xiàn)紅色為VP陽(yáng)性反應(yīng)。將剩下培養(yǎng)液繼續(xù)于35℃培養(yǎng)48h，加甲基紅指示劑1滴于試管中，出現(xiàn)紅色為MR陽(yáng)性反應(yīng)。李斯特氏菌為陽(yáng)性反應(yīng)。100/135（9）三糖鐵試驗(yàn)用TSB-YE肉湯培養(yǎng)物接種于三糖鐵瓊脂（TSI），于35℃培養(yǎng)5d。李斯特氏菌在斜面和底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)硫化氫（H2S）三糖鐵瓊脂(TSI)成份：蛋白胨20.0g，牛肉膏3.0g，乳糖10.0g，蔗糖10.0g，葡萄糖1.0g，硫酸亞鐵銨(含6個(gè)結(jié)晶水)0.5g，酚紅0.025g或5g/L溶液5mL，氯化鈉5.0g，硫代硫酸鈉0.5g，瓊脂12.0g，蒸餾水1000.0mL

除酚紅和瓊脂外,將其它成份加入400mL蒸餾水中,攪拌均勻,靜置約10min,加熱煮沸至完全溶解,調(diào)至pH7.4±0.1。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中,攪拌均勻,靜置約10min,加熱煮沸至完全溶解。

將上述兩溶液混合均勻后,再加入酚紅指示劑,混勻,分裝試管(12mm×100mm),每管約2～4mL,高壓滅菌121℃10min或115℃15min,滅菌后置成高層斜面,呈桔紅色。101/135102/135（10）糖發(fā)酵試驗(yàn)：將TSA－YE肉湯培養(yǎng)物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)（可選取倒立發(fā)酵管），35℃培養(yǎng)24－48h，陰性繼續(xù)培養(yǎng)到第5天，呈陽(yáng)性反應(yīng)李斯特氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。應(yīng)為黃色。103/135（11）尿酸酶試驗(yàn)用TSB－YE肉湯培養(yǎng)物穿刺接種于尿素瓊脂斜面上，于35℃培養(yǎng)5d，逐日觀察李斯特氏菌呈尿酸酶試驗(yàn)陰性反應(yīng)，斜面無(wú)顏色改變104/135（12）血清學(xué)檢驗(yàn)將TSBYE肉湯培養(yǎng)物用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩下液與沉淀混勻制成菌懸液，進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)。105/135106/135李斯特氏菌屬區(qū)分V:反應(yīng)不定107/135（二）控制單增李斯特氏菌在普通熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌群，使單增李斯特氏菌在沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境條件下易于存活，所以在食品加工中，中心溫度必須到達(dá)70℃連續(xù)2分鐘以上。單增李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產(chǎn)品已經(jīng)過(guò)熱加工處理充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產(chǎn)品二次污染，所以蒸煮后預(yù)防二次污染是極為主要。因?yàn)閱卧隼钏固厥暇?℃下依然能生長(zhǎng)繁殖，所以未加熱冰箱食品增加了食物中毒危險(xiǎn)。冰箱食品需加熱后再食用。108/135美研制出快速李斯特菌傳感器最近，美國(guó)Purdue大學(xué)食品科學(xué)家研制出一個(gè)涂有特殊抗體玻璃纖維傳感器，這種傳感器對(duì)李斯特菌有專(zhuān)門(mén)選擇性，能夠在24小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)出每毫升液體中低于1000個(gè)李斯特菌細(xì)菌。傳惑器用小塊光學(xué)玻璃纖維制成。光學(xué)纖維光亮、牢靠、可塑性強(qiáng)、光線很輕易經(jīng)過(guò)。在纖維上涂一層叫抗體分子膜，它能特定識(shí)別李斯特菌，并將其捕捉，捆綁到纖維上。將這種玻璃纖維傳感器放置到液體食品中，食品中李斯特菌就會(huì)粘在纖維上。109/135第五節(jié)

霉菌和酵母菌及其檢驗(yàn)110/135一霉菌和酵母菌介紹和衛(wèi)生學(xué)意義酵母菌是真菌中一大類(lèi)，通常是單細(xì)胞，呈圓形,卵圓形、臘腸形或桿狀。霉菌也是真菌，能夠形成疏松絨毛狀菌絲體真菌稱(chēng)為霉菌。111/135112/135對(duì)食品影響霉菌和酵母廣泛分布于自然界并可作為食品中正常菌相一部分。長(zhǎng)久以來(lái)，人們利用一些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鮮美可利用霉菌和酵母釀酒、制醬食品、化學(xué)、醫(yī)藥等工業(yè)都少不了霉菌和酵母。在一些情況下，霉菌和酵母也可造成腐敗變質(zhì)。因?yàn)樗鼈兩L(zhǎng)遲緩和競(jìng)爭(zhēng)能力不強(qiáng)，故經(jīng)常在不適于細(xì)菌生長(zhǎng)食品中出現(xiàn)，這些食品是pH低、濕度低、含鹽和含糖高食品、低溫貯藏食品，含有抗菌素食品等。113/135因?yàn)槊咕徒湍改艿挚篃?、冷凍，以及抗菌素和輻照等貯藏及保藏技術(shù)，它們能轉(zhuǎn)換一些不利于細(xì)菌物質(zhì)，而促進(jìn)致病細(xì)菌生長(zhǎng)；有些霉菌能夠合成有毒代謝產(chǎn)物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。比如，酵母在新鮮和加工食品中繁殖，可使食品發(fā)生難聞異味，它還能夠使液體發(fā)生混濁，產(chǎn)生氣泡，形成薄膜，改變顏色及散發(fā)不正常氣味等114/135所以霉菌和酵母也作為評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量指示菌，并以霉菌和酵母計(jì)數(shù)來(lái)制訂食品被污染程度。當(dāng)前已經(jīng)有若干個(gè)國(guó)家制訂了一些食品霉菌和酵母限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)已制訂了一些食品中霉菌和酵母限量標(biāo)準(zhǔn)。115/135皮革上霉菌116/135二、檢驗(yàn)方法霉菌和酵母計(jì)數(shù)方法，與菌落總數(shù)測(cè)定方法基本相同。主要步驟為：將樣品制作成10倍梯度稀釋液，選擇3個(gè)適當(dāng)稀釋度，吸收1mL于平皿，傾注培養(yǎng)基后，培養(yǎng)觀察，計(jì)數(shù)。對(duì)霉菌計(jì)數(shù)，還能夠采取顯微鏡直接鏡檢計(jì)數(shù)方法。詳細(xì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)：GB4789.15-94，《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》117/135檢驗(yàn)步驟1．樣品處理。為了準(zhǔn)確測(cè)定霉菌和酵母數(shù)，真實(shí)反應(yīng)被檢食品衛(wèi)生質(zhì)量，首先應(yīng)注意樣品代表性。對(duì)大固體食品樣品，要用滅菌刀或鑷子從不一樣部位采取試驗(yàn)材料，再混合磨碎。如樣品不太大，最好把全部樣品放到滅菌均質(zhì)器杯內(nèi)攪拌2min。液體或半固體樣品可用快速顛倒容器25次來(lái)混勻。118/1352．樣品稀釋為了降低稀釋倍數(shù)誤差，在連續(xù)遞增稀釋時(shí)，每一稀釋度應(yīng)更換一根吸管。在稀釋過(guò)程中，為了使霉菌孢子充分散開(kāi)，需用滅菌吸管重復(fù)吹吸50次。119/1353．培養(yǎng)基選擇：在霉菌和酵母計(jì)數(shù)中，主要使用以下幾個(gè)選擇性培養(yǎng)基。馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。用PDA作平板計(jì)數(shù)時(shí)，必項(xiàng)加入抗菌素以抑制細(xì)菌。酵母菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上在28℃培養(yǎng)48h后，乳白色菌落，有突起。120/135霉菌在孟加拉紅瓊脂（虎紅瓊脂）上經(jīng)典特征孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基：該培養(yǎng)基中孟加拉紅和抗菌素含有抑制細(xì)菌作用。孟加拉紅還可抑制霉菌菌落蔓延生長(zhǎng)。在菌落后面由孟加拉紅產(chǎn)生紅色有利于霉菌和酵