蛋白質(zhì)的純化課件123

梁賈春子汪淳管家偉梁玉蓮關(guān)丹丹蛋白質(zhì)工程1世界生命科學(xué)的圣地與分子生物學(xué)的搖籃--冷泉港實(shí)驗(yàn)室（TheColdSpringHarborLaboratory）2蛋白質(zhì)工程中進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化的必要性化學(xué)修飾法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改造時(shí)需要單一的蛋白質(zhì)作為原材料為了研究蛋白質(zhì)工程的效果，需要單一的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)材料研究其結(jié)構(gòu)與功能為了生產(chǎn)性能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)，需要對(duì)設(shè)計(jì)改造過的蛋白質(zhì)進(jìn)行大量純化，從而開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品3一、蛋白純化方法能從成千上萬種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)的原因是不同蛋白質(zhì)在許多理化性質(zhì)上有著極大的不同。這些理化性質(zhì)的不同是由于氨基酸的數(shù)目和序列不同造成的。41.與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性分子大小分子形狀帶電特性溶解特性與配體特異性結(jié)合不同吸附性質(zhì)變性和復(fù)性51.1分子大小大小蛋白質(zhì)的分子大小主要取決于蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百—百萬Da常用方法透析超濾凝膠過濾離心6原理：透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。透析法7超速離心81.2分子形狀形狀形狀的不同會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)在離心通過溶液時(shí)，或通過膜、凝膠過濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運(yùn)動(dòng)時(shí)，都會(huì)受到它的形狀的影響。方法梯度離心的影響電泳的影響91.3電荷原理蛋白質(zhì)的凈電荷取決于氨基酸殘基所帶正、負(fù)電荷總和。若天冬氨酸和谷氨酸占優(yōu)勢，在pH7.0時(shí)帶凈負(fù)電荷，稱為酸性蛋白質(zhì)。若賴氨酸和精氨酸占優(yōu)勢，在pH7.0時(shí)帶凈正電荷，稱為堿性蛋白質(zhì)。方法電泳離子交換層析101.4溶解度原理由于蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團(tuán)不同，因此在溶劑中的溶解度不同。方法：通過改變pH、離子強(qiáng)度或加入有機(jī)試劑，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的凝聚進(jìn)而形成沉淀。沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法111.5配體特異性結(jié)合原理生物大分子的某些特定結(jié)構(gòu)能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，這種結(jié)合是特異的又是可逆的，生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。方法將具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。分類免疫親和層析生物親和層析金屬螯合親和層析擬生物親和層析121.6變性和復(fù)性原理蛋白質(zhì)在一定的理化條件下會(huì)失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性等稱為變性。當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能即為復(fù)性。方法尿素變性復(fù)性從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白132.分離方法沉淀法離心法電泳法超濾法相分配法層析法1415不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純化所有的蛋白質(zhì)，但每一種蛋白質(zhì)可能都有一套適合的分離純化程序，而且所用的主要技術(shù)手段都基本相同。16二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟總原則以合理的效率、速度、收率和純度，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來，同時(shí)仍保留其生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。步驟選擇實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的粗分級(jí)蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)蛋白質(zhì)的鑒定17蛋白質(zhì)純化的前期準(zhǔn)備什么是最好的來源：蛋白質(zhì)需要有多純：純化蛋白的量要多少：蛋白質(zhì)應(yīng)該如何進(jìn)行鑒定：純化時(shí)間應(yīng)該多長:什么是最終花費(fèi)：如何純化蛋白質(zhì)：關(guān)于蛋白質(zhì)我們已知什么：183、蛋白質(zhì)的粗分級(jí)使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實(shí)驗(yàn)材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時(shí)去除大量的雜質(zhì)，這些純化方法就屬于蛋白質(zhì)的粗分級(jí)。硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀、超速離心、等電點(diǎn)沉淀、透析、超過濾、蛋白質(zhì)結(jié)晶等。194、蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)粗分級(jí)只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進(jìn)一步純化，這就是蛋白質(zhì)細(xì)分級(jí)。常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：層析和電泳20四、蛋白質(zhì)的鑒定測定蛋白