蛋白質(zhì)和氨基酸的測定p4概述課件

第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定(p114)

第一節(jié)概述蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%~13%總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。動物蛋白和豆類蛋白是優(yōu)良的蛋白質(zhì)資源。蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即1份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)換算系數(shù)。第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定(p114)

第一節(jié)概述1氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中20種，二在構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠食品供給，故被稱為必須氨基酸。蛋白質(zhì)的測定方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，構(gòu)成2食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，最常用的方法是凱氏定氮法：它是測定總有機氮的最準(zhǔn)確和操作較簡便的方法之一。該法是通過測出樣品中的總含氮量，然后乘一個蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測）。目前，測定蛋白質(zhì)和氨基酸含量的方法很多，如：雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法等。國外：紅外分析儀。氨基酸總量：酸堿滴定法測定。各種氨基酸的分離與定量——色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，最3第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)（一）氨基黑法：氨基黑10B是酸性染料，其磺基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。①經(jīng)點樣后的層析紙經(jīng)電泳或?qū)游龊?，浸入氨基?0B乙酸甲醇溶液中染色10min，染色后，用10％乙酸甲醇溶液洗滌5-7次，待背景變成淺藍色后干燥。若欲進行洗脫，用0.1mol/L氫氧化鈉浸泡30min，于595nm波長下比色測定。氨基黑10B乙酸甲醇溶液：13g氨基黑10B溶解于100ml冰乙酸和900ml甲醇中，充分搖勻，放置過夜，過濾后可反復(fù)使用幾次。②聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色：③凝膠薄層的直接染色：本法優(yōu)點是靈敏度較高，缺點是花費時間長，不同蛋白質(zhì)染色強度不同。第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)4（二）溴酚藍法：經(jīng)電泳或?qū)游龊鬄V紙或凝膠于0.1％溴酚藍固定染色液（1g溴酚藍，100g氯化汞溶于50％乙醇水溶液中，用50％乙醇稀釋至1000ml）中浸泡15－20min，在30％乙醇：5％乙酸水溶液中漂洗過夜。如欲洗脫，可用0.1mol/L氫氧化鈉。此法缺點是靈敏度低，某些低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)可能染不上色。（二）溴酚藍法：5（三）考馬斯亮藍法：該染料和蛋白質(zhì)是通過范得華力結(jié)合的。考馬斯亮藍含有較多的疏水基團，和蛋白質(zhì)的疏水區(qū)有較大的親和力，而和凝膠基質(zhì)的親和力不如氨基黑，所以用考馬斯亮藍染色時漂洗較容易。①經(jīng)電泳后濾紙或乙酸纖維膜在200g/L磺基水楊酸溶液中浸1min，取出后放入2.5g/L考馬斯亮藍R250染色液中浸5min，在蒸餾水或7％乙酸中洗四次，每次5min，于90℃放置15min。②聚丙烯酰胺凝膠處理：凝膠用10％三氯乙酸固定，在10％三氯乙酸－1％考馬斯亮藍R250（19＋1）中室溫染色0.5h，用10％三氯乙酸脫底色。考馬斯亮藍靈敏度比氨基黑高5倍，尤其適用于SDS電泳的微量蛋白質(zhì)的染色。在549nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在1-10μg呈線性關(guān)系。（三）考馬斯亮藍法：6（四）酸性品紅法：經(jīng)電泳后濾紙置于0.2％酸性品紅溶液中（2g酸性品紅溶解于500ml甲醇，400ml蒸餾水和100ml冰乙酸中）加熱染色15min；取出后浸入乙酸甲醇溶液（500ml甲醇，400ml蒸餾水和100ml冰乙酸）15min；然后浸入10％乙酸溶液，每次20min，至背景無色為止。如欲進行比色，可用0.1mol/L氫氧化鈉浸泡2h，在波長570nm處比色。（五）氨基萘酚磺酸法：聚丙烯酰胺凝膠電泳后，把凝膠暴露在空氣中幾分鐘，或在2mol/LHCl中浸一下使表層蛋白變性，再在0.003％氨基萘酚磺酸的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（Ph6.8）中染3min，在紫外光下可顯黃綠色熒光。這樣的染色可保留凝膠內(nèi)部的酶和抗體的活性。如不需保留活性，可先在3mol/LHCl中浸2min以上使蛋白質(zhì)充分變性，在染色。（四）酸性品紅法：7二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色：1、過碘酸－Schiff氏試劑顯色法：①試劑：過碘酸液；還原液；亞硫酸品紅液；亞硫酸鹽沖洗液等。②顯色步驟：將含有樣品的濾紙浸在70％乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸5min，用70％乙醇洗1次，在還原液中浸5-8min，再用70％乙醇洗1次，在亞硫酸品紅液中浸24-25min，用亞硫酸鹽沖洗液洗3次，并用乙醇脫水后，放在玻璃板上吹干。顯色結(jié)果：在黑灰色的底板上呈現(xiàn)紫紅色。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)82、甲苯胺藍顯色法：①試劑：試劑甲：1.2g過碘酸溶解在30ml蒸餾水中，加15ml0.5mol/L乙酸鈉和100ml96％乙醇。現(xiàn)配現(xiàn)用。試劑乙：100ml甲醇加20ml冰乙酸及80ml蒸餾水。試劑丙：溴水，試劑?。?0g/L甲苯胺藍水溶液，試劑戊：40g/L鉬酸銨溶液。②顯色步驟：將點有樣品的濾紙依次在試劑甲中浸15min，試劑丙溴水中浸15min，用自來水漂洗，再在試劑丁中浸30min，自來水漂洗至沒有藍色染料滲出（30-40min）后，再依次在試劑戊中浸3min，試劑乙中浸15min，丙酮中浸2min后在空氣中干燥。顯色結(jié)果：糖蛋白部分染成藍色，背景帶有紅紫色。2、甲苯胺藍顯色法：93、阿爾新藍顯色法：聚丙烯酰胺凝膠在12.5％三氯乙酸中固定30min后，再用蒸餾水輕輕漂洗。放入1％過碘酸液（在3％乙酸中）中氧化50min。用蒸餾水反復(fù)洗滌去除多余的過碘酸鹽，再放入0.5％偏重亞硫酸鉀中還原剩余的過碘酸鹽30min，再用蒸餾水洗滌，浸在0.5％阿爾新藍（在3％乙酸中）溶液中染4h。3、阿爾新藍顯色法：10（二）脂蛋白的顯色：1、蘇丹黑顯色法：將0.1g蘇丹黑B溶解于煮沸的100ml60％的乙醇溶液中，制備成飽和溶液，冷卻后過濾兩次，備用。顯色時將點有樣品的濾紙浸于上述溶液中，3h后取出，用50％乙醇溶液洗滌兩次，每次15min，空氣干燥。聚丙烯酰胺凝膠電泳中預(yù)染法：加蘇丹黑B到無水乙醇中成飽和液，并振搖使乙?；?。用前過濾。按樣品液的1/10量加入樣品液中染色1h或4℃過夜，染色后的樣品再進行電泳。（二）脂蛋白的顯色：112、油紅－O顯色法：0.04g油紅－O溶解于100ml60％乙醇中，30℃放置過夜（16h）使充分飽和后，在30℃下濾去多余的染料，澄清液即可用于染色。將濾紙浸入染料液中，在30℃下染色18h后，用水沖洗，使背景變淺，在空氣中干燥。脂蛋白為紅色，背景為桃紅色。本法在30℃以下顯色時，會引起染料沉淀。2、油紅－O顯色法：12第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定一般說來，動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉9.5%，兔肉21%，雞肉20%，牛乳3.5%，帶魚18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黃瓜1.0%，蘋果1.4%。測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。一些蛋白質(zhì)的含氮量一般為15%～17.6%，有的上下浮動，可以測出總氮N。第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定13一、凱氏定氮法凱式定氮法可用于所有動植物食品的蛋白質(zhì)含量測定，但因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，故結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。由Kieldhl于1833年提出，經(jīng)過長時間的改進，迄今已演變?yōu)槌Ａ?、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法，書中只介紹前三種。一、凱氏定氮法14（一）常量凱氏定氮法：1、原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。①用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含量。②也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定。（一）常量凱氏定氮法：15（1）樣品消化：總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4＝NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%），濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮；濃硫酸又具有氧化性，將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原為二氧化硫。二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。在消化反應(yīng)中，為加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時間，常加入下列物質(zhì)：①硫酸鉀：作為增溫劑，加入硫酸鉀可以提高溶液沸點而加快有機物分解。純硫酸沸點340℃，至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。②硫酸銅：硫酸銅起催化劑的作用。還可以指示消化終點的到達，以及下一步蒸餾時作為堿性反應(yīng)的指示劑。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。③氧化劑：如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機物氧化速度。（1）樣品消化：16（2）蒸餾：消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。（3）吸收與滴定：①用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠混合指示劑）國標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。指示劑：紅色→綠色→紅色（酸）（堿）（酸）②用過量的H2SO4或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。（2）蒸餾：172、儀器此法可用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定，是國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T5009.5-1985）。3、試劑4、操作方法取樣：固體樣品0.2-2g，半固態(tài)樣2-5g，液體樣品10-20ml。消化劑：硫酸銅0.5g，硫酸鉀10g，濃硫酸20ml。消化結(jié)束：液體變藍綠色透明后，再繼續(xù)加熱微沸30min。蒸餾：以奈氏試劑檢查，如無紅棕色物生成，表示蒸餾完畢，即可停止加熱。以奈氏試劑〔Nessler試劑，K2（HgI4）〕檢驗NH4+離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀。配制：方法1：3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。方法2：溶解11.5gHgI2+KI10g于適量少許水，后加水稀釋至50ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲存于棕色瓶中。2、儀器185、結(jié)果計算：式中：c－HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1－滴定樣品吸收液時消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；V2－滴定空白吸收液時消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；m－樣品質(zhì)量，g；F－氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；M－1/2N2摩爾質(zhì)量，14.01g/moL。5、結(jié)果計算：196、說明及注意事項：①所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。②消化時不要用強火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。③消化時應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進其消化完全。④樣品中若含脂肪較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應(yīng)用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。⑤當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2－3m1后再繼續(xù)加熱消化。6、說明及注意事項：20⑥若取樣量較大，如干試樣超過5g可按每克試樣5m1的比例增加硫酸用量。⑦—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品．如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。⑧蒸餾裝置不能漏氣。⑨蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，此時需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在70～90℃時發(fā)黑。⑩硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時可置于冷水浴中使用。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。⑥若取樣量較大，如干試樣超過5g可按每克試樣5m1的21（二）微量凱氏定氮法：1、原理：同常量凱氏定氮法。2、儀器3、試劑4、操作方法：與常量法不同點：加入硼酸量有50ml→10ml；滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L→0.01mol/L；可用微量滴定管。取樣量較少。樣品消化步驟同常量法。滴定：餾出液用0.01000mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點。同時做一空白試驗。（二）微量凱氏定氮法：225、結(jié)果計算6、說明：①蒸餾前給水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升以使其始終保持酸性，這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測定結(jié)果。②20g/L硼酸吸收液每次用量為25ml，用前加入甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑兩滴。③在蒸餾時，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得?；饠鄽?，否則將發(fā)生倒吸。加堿要足量，操作要迅速；漏斗應(yīng)采用水封措施，以免氨由此逸出損失。5、結(jié)果計算23（三）自動凱氏定氮法：是指將常量凱氏定氮裝置組裝成具有自動操作功能的一套裝置，其原理與試劑與常量法相同，操作方法如下：①稱取0.50-1.00g樣品，置于消化瓶內(nèi)，加入硫酸銅和硫酸鉀制成的片劑兩片，加入濃硫酸10ml，將消化瓶置于紅外線消化爐中，用連接管密封住消化瓶，開啟抽氣裝置，開啟消化爐電源，30min后8個樣品消化完畢，消化液完全澄清并呈綠色。②取出消化瓶，移裝于自動凱氏定氮儀中，連接開啟加水電鈕，加堿電鈕、自動蒸餾滴定電鈕，開啟電源，約經(jīng)12min后由數(shù)顯裝置即可給出樣品總氮百分含量，并記錄樣品總氮百分比。根據(jù)換算系數(shù)F即可得出樣品中蛋白質(zhì)含量。③開啟排廢液電鈕和加水電鈕，排出廢液并對消化瓶進行清洗1次。（三）自動凱氏定氮法：24二、雙縮脲法（一）原理：當(dāng)脲（尿素，NH2—CO—NH2）加熱至150~160℃時，兩分子縮和成雙縮脲。NH2－CO－NH2+NH2－CO－NH2→NH2－CO－NH－CO－NH2+NH3雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)（縮二脲反應(yīng)）。由于蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵－CO－NH－，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。故也能出現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm。注：測蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化二、雙縮脲法25（二）方法特點及應(yīng)用范圍：本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。（三）儀器：分光光度計，離心機（4000r/min）。（四）試劑：堿性硫酸銅溶液；四氯化碳。（五）操作方法：①采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。②樣品測定：準(zhǔn)確稱取樣品適量（使蛋白質(zhì)含量在40-110mg之間）于50ml納氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步驟顯色后，在相同條件下測定吸光度A。用測得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得蛋白質(zhì)毫克數(shù)，進而由此求得樣品中的蛋白質(zhì)含量。（六）結(jié)果計算：蛋白質(zhì)含量＝m×100/m1（mg/100g）式中：m－由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m1－樣品質(zhì)量，g。（二）方法特點及應(yīng)用范圍：26（七）說明及注意事項：①蛋白質(zhì)種類不同，對發(fā)色程度影響不大。②標(biāo)準(zhǔn)曲線制作完整后，無需每次再作標(biāo)準(zhǔn)曲線。③含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚脫脂。④樣品中有不溶性成分存在時，會給比色測得帶來不便，此時可預(yù)先將蛋白質(zhì)抽出后再進行測得。⑤當(dāng)肽鏈中含脯氨酸時，若有多量糖類共存，則顯色不好，會使測得值偏低。⑥堿性硫酸銅溶液由0.1mol氫氧化鉀、5g酒石酸鉀鈉，1.6g硫酸銅溶于水后加水至1000ml配成。（七）說明及注意事項：27三、紫外吸收法（一）A280nm光吸收法：1、原理：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物（胨、肽和氨基酸）的芳香環(huán)殘基【—NH—CH（R）—CO—】在紫外區(qū)內(nèi)對一定波長的光具有選擇吸收作用，在波長（280nm）下，光吸收程度與蛋白質(zhì)濃度（3—8mg/mL）成直線關(guān)系，因此，通過測定蛋白質(zhì)的吸光度，并參照事先用凱式定氮法測定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品蛋白質(zhì)含量。三、紫外吸收法282、適用范圍：本法操作簡單迅速，常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3、儀器4、試劑5、操作方法：①制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：②樣品的測定：準(zhǔn)確稱取試樣1.00g，如前處理，吸取的每毫升樣品溶液中含有3-8mg的蛋白質(zhì)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作條件測定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)的含量。6、結(jié)果計算：蛋白質(zhì)含量＝m×100％（％）式中：m－由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m1－測定樣品溶液所相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，mg。2、適用范圍：297、說明及注意事項：①測定牛奶樣品時的操作：準(zhǔn)確吸取混合均勻的樣品0.2ml于25ml納氏比色管中，用95％-97％的冰乙酸稀釋至標(biāo)線，搖勻，以95％-97％的冰乙酸為參比液，用1cm比色皿于280nm處測定吸光度，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品蛋白質(zhì)含量。②測定糕點時，應(yīng)將表皮的顏色去掉。③溫度對蛋白質(zhì)水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在20-30℃。7、說明及注意事項：30（二）肽鍵紫外光測定法：蛋白質(zhì)溶液在238nm下均有光吸收，其吸收強弱與肽鍵多少成正比，根據(jù)這一性質(zhì)，可測定樣品在238nm下的吸收值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液作對照，求出蛋白質(zhì)含量。本法比280nm吸收法靈敏。在50-500mg/L蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。A260nm和A280nm比值法：1、原理：凡是有共軛雙鍵的物質(zhì)，均具有紫外吸收值。因此，若樣品中含有核酸，則嘌呤、嘧啶類堿基對蛋白質(zhì)的測定產(chǎn)生干擾，應(yīng)加以校正。核酸在260nm處的紫外吸收值大于280nm處的，但蛋白質(zhì)剛好相反。利用此性質(zhì)，通過計算可以適當(dāng)校正核酸對測定蛋白質(zhì)濃度的干擾。（二）肽鍵紫外光測定法：312、測定：取一定量的樣品稀釋液，分別測定樣品的A260nm和A280nm，計算A280nm/A260nm的比值后，從表10-2中查出校正因子F值，同時可查出該樣品中混雜的核酸質(zhì)量分數(shù)。將F值代入，由下列公式可直接計算該樣品的蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量＝F×A280nm×n/d（mg/ml）式中：A280nm－該樣品液在280nm波長下的吸收值；d－石英杯的厚度，cm；n－樣品的稀釋倍數(shù)。2、測定：32A215nm和A225nm的吸收差法：3、樣品測定：取一定量的樣品液，以蒸餾水調(diào)零，分別測定A215nm和A225nm，并求出差值A(chǔ)215nm－A225nm，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收差值作對照，求出樣品蛋白質(zhì)含量。本法在20-100mg/L蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。A215nm和A225nm的吸收差法：33四、福林－酚比色法（一）原理：蛋白質(zhì)與福林（Folin）－酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍色復(fù)合物。作用機理主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性酮鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時也由于蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸－磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。呈色強度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。（二）試劑：福林－酚試劑甲，福林－酚試劑乙，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/ml）。四、福林－酚比色法34（三）操作方法：吸取一定量的樣品稀釋液，加入試劑甲3.0ml，置于25℃水浴中保溫10min，再加入試劑乙0.3ml，立即混勻，保溫30min，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測定A750nm值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液作對照，求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。本法在0—60mg/L蛋白質(zhì)范圍呈良好線性關(guān)系。（四）說明：福林－酚法靈敏度高，酚類和檸檬酸對該法均有干擾。（三）操作方法：35五、考馬斯亮藍染料比色法（一）原理：考馬斯亮藍G－250是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過范得華引力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在620nm處有最大吸收值，可用于蛋白質(zhì)的定量測定。此法簡單迅速，適合大量樣品的測定，靈敏度與福林－酚法相似。但不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響。（二）試劑：①牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；②染料試劑：稱取考馬斯亮藍G-25060mg，溶于100ml,3％過氯酸溶于中，過濾，儲于棕色瓶中。（三）操作方法：吸取樣品液2ml，加染料試劑2ml，混勻，以介質(zhì)溶于調(diào)零，測定A620nm，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對照，求出蛋白質(zhì)含量。本法在0-100mg/L蛋白質(zhì)范圍呈良好的線性關(guān)系。五、考馬斯亮藍染料比色法36六、水楊酸比色法（一）原理：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化而轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度條件下可與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成藍色化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，進而計算出蛋白質(zhì)含量。（二）儀器（三）試劑（四）操作方法：①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：②樣品處理：取樣0.20-1.00g，加入15ml濃硫酸，0.5g硫酸銅和4.5g無水硫酸鈉，消化。③樣品測定：取一定量消化液定容，比色。六、水楊酸比色法37（五）結(jié)果計算：總氮量＝（m×K）×100％/（m1×1000×1000）式中：m―從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣液含氮量，μg；K―樣品溶液稀釋倍數(shù)；m1－樣品質(zhì)量，g。（四）說明：①應(yīng)在樣品消化當(dāng)天進行比色測定；②溫度對顯色影響很大，應(yīng)嚴(yán)格控制溫度；③此法結(jié)果與凱氏定氮基本一致；④試劑配制必須標(biāo)準(zhǔn)。（五）結(jié)果計算：38七、紅外光譜法（一）原理：食品中不同的功能基團吸收不同頻率的輻射。對于蛋白質(zhì)和多肽，多肽鍵在中紅外波段（6.47μm）和近紅外波段（3300-3500nm，2028-2220nm，1560-1670nm）的特征吸收可用于測定食品中的蛋白質(zhì)含量。（二）應(yīng)用：紅外牛乳分析儀采用中紅外光譜法測定牛乳蛋白質(zhì)含量，近紅外光譜儀也廣泛應(yīng)用于食品蛋白質(zhì)分析。七、紅外光譜法39八、4,4’-二羧基-2,2－聯(lián)喹啉（BCA）法（一）原理：二價銅離子在堿性條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子，一價銅離子和獨特的BCA試劑（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個一價銅離子，形成淺紫色的反應(yīng)復(fù)合物。反應(yīng)形成顏色的深淺與一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度成正比。（二）方法：①蛋白質(zhì)溶液和含有BCA鈉鹽、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、pH11.25的BCA試劑一步混合；②在37℃保溫30min或室溫下放置2h，或60℃保溫30min。溫度的選擇取決于靈敏度的要求。較高的溫度導(dǎo)致較深的顏色反應(yīng)；③在562nm處比色測定，并作空白試驗；④用BSA（牛血清蛋白）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（三）應(yīng)用：BCA法已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離和純化中。此法對測定復(fù)雜食品體系中蛋白質(zhì)的適用性還未見報道。八、4,4’-二羧基-2,2－聯(lián)喹啉（BCA）法40優(yōu)點：①靈敏度與福林－酚法相似，微量BCA法的靈敏度（0.5-10μg）稍高于福林－酚法；②一步混合的操作更簡單；③所用試劑比福林－酚法簡單；④非離子型表面活性劑和緩沖液不對反應(yīng)產(chǎn)生干擾；⑤中等濃度的變性劑（4mol/L鹽酸胍或3mol/L尿素）不對反應(yīng)產(chǎn)生干擾缺點：①反應(yīng)產(chǎn)生的顏色不穩(wěn)定，需要仔細控制比色時間；②還原糖對此反應(yīng)產(chǎn)生的干擾比對福林－酚法更大；③不同蛋白質(zhì)反應(yīng)引起的顏色變化與福林－酚法相似；④比色的吸光度與蛋白質(zhì)濃度不成線性關(guān)系。優(yōu)點：41九、比濁法（一）原理：低濃度（3％－10％）的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙酸中的鐵氰化鉀能使提取的蛋白沉淀形成蛋白質(zhì)顆粒的懸濁液。其濁度可由輻射光傳送過程中的衰減而確定，輻射光傳送過程中的衰減是由于蛋白質(zhì)顆粒的散射造成的，輻射光衰減的程度與溶液中的蛋白質(zhì)濃度成正比。九、比濁法42（二）操作方法：測定小麥蛋白質(zhì)的常規(guī)方法為磺基水楊酸法，具體如下：①小麥面粉用0.05mol/L氫氧化鈉溶液萃取；②將溶于堿性溶液的蛋白質(zhì)從原料中離心分離；③磺基水楊酸和蛋白質(zhì)溶液混合；④在540nm處測定其濁度，并扣去空白；⑤蛋白質(zhì)的含量可根據(jù)凱氏定氮法校正過的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算。（二）操作方法：43（三）應(yīng)用：比濁法已經(jīng)用于測定小麥面粉和玉米的蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點：①快速、可在15min內(nèi)完成；②測定結(jié)果不包括除了核酸外的非蛋白質(zhì)含量。缺點：①不同的蛋白質(zhì)沉淀速度不同；②濁度隨酸試劑濃度的不同而變化；③核酸也能被酸試劑沉淀。（三）應(yīng)用：44十、杜馬斯法（燃燒法）（一）原理：樣品在高溫下（700-800℃）燃燒，釋放的氮氣由帶熱導(dǎo)檢測器（TCD）的氣相色譜儀測定。測得的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的蛋白質(zhì)含量。（二）操作方法：樣品（100-500mg）稱量后置于樣品盒中，放入具有自動裝置的燃燒反應(yīng)器中，釋放的氮氣由內(nèi)置的氣相色譜儀測定。（三）應(yīng)用：燃燒法適用于所有種類的食品，AOAC方法992.15和992.23分別用于肉類和谷物食品。十、杜馬斯法（燃燒法）45優(yōu)點：①是凱氏定氮法的一個替代法；②不需要任何有害化合物；③可在3min內(nèi)完成；④最先進的自動化儀器可在無人看管的狀態(tài)下分析多達150個樣品。缺點：①需要的儀器昂貴；②非蛋白氮也包括在內(nèi)。優(yōu)點：46第四節(jié)蛋白質(zhì)的末端測定一、N－末端測定－丹磺?；ǎㄒ唬┰恚旱鞍踪|(zhì)的α－氨基與丹磺酰氯（DNS-Cl）反應(yīng)，生成DNS-蛋白質(zhì)，經(jīng)水解可生成DNS－氨基酸。通過分析DNS－氨基酸，可確定蛋白質(zhì)的N－末端氨基酸。（二）儀器和試劑第四節(jié)蛋白質(zhì)的末端測定一、N－末端測定－丹磺?；?7（三）操作方法：1、氨基酸的丹磺?；翰捎脤游龇ǖ玫礁鞣NDNS-氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。2、蛋白質(zhì)樣品N-末端氨基酸的DNS化：取樣0.5mg，置于具塞玻璃試管中，用少量水溶解后，加入0.5mL，0.2mol/L碳算清鈉溶液。再加入0.5mlDNS-Cl丙酮溶液，用三乙胺調(diào)至pH9.0-9.5，塞好塞子，于40℃烘箱中反應(yīng)2h，或室溫放置2-4h，生成DNS-蛋白質(zhì)。（三）操作方法：483、DNS-蛋白質(zhì)水解：DNS化反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸去丙酮，加入0.5ml，6mol/L鹽酸溶解DNS-蛋白質(zhì)。全部移入水解管，抽真空封管，于110℃烘箱中水解18-24h。開管后蒸去鹽酸，加少量水，在蒸干。重復(fù)2-3次，除盡鹽酸。4、DNS-氨基酸的抽提：將上述水解產(chǎn)物加0.5ml水，用1mol/LHCl調(diào)至pH2-3。加入0.5ml乙酸乙酯抽提，除去乙酸乙酯，于干燥器中備用。5、DNS-氨基酸的層析與檢測：將抽提的DNS-氨基酸和標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸分別進行聚酰胺薄膜層析。將圖譜用360nm或280nm波長的紫外燈檢測，進行比較。3、DNS-蛋白質(zhì)水解：49二、蛋白質(zhì)及多肽C-末端測定及順序分析（羧肽酶法）（一）原理：一般先進行末端基測定，然后進行順序分析。通常C－末端基測定要比N－末端基的測定困難。目前普遍采用羧肽酶法進行C-末端基測定及C-端氨基酸順序分析。羧肽酶是一類外肽酶，這些酶與蛋白質(zhì)或多肽作用時，能從C-末端氨基酸殘基開始順序降解，并逐個釋放出游離C－端氨基酸。二、蛋白質(zhì)及多肽C-末端測定及順序分析（羧肽酶法）50蛋白質(zhì)或多肽在羧肽酶作用下，被逐步降解及釋放的氨基酸種類和數(shù)目隨時間而發(fā)生變化，將經(jīng)過一定間隔時間反應(yīng)的樣品分別取出，進行酸化失活處理后可用自動分析儀或HPLC儀進行快速測定，根據(jù)不同時間取樣的分析結(jié)果便能初步確定C-末端基為何種氨基酸。若以酶作用時間為橫坐標(biāo)，對所釋放的各氨基酸量（mol/L）為縱坐標(biāo)作圖，然后根據(jù)氨基酸釋放的動力學(xué)曲線即可進一步判斷和確定肽鏈C端的氨基酸順序。肽鏈C端的氨基酸順序測定的關(guān)鍵在于測出第一個釋放的為何種氨基酸，一般最好采用兩種以上C－末端測定方法進行比較和驗證才可靠。蛋白質(zhì)或多肽在羧肽酶作用下，被逐步51（二）試劑：羧肽酶Y；牛胰核糖核酸酶A；降解緩沖液。（三）操作步驟：1、酶液和樣品溶液的制備：2、樣品酶解：3、氨基酸分析：取上清液用自動氨基酸分析儀進行氨基酸定性或定量分析。（二）試劑：52（四）實驗結(jié)果：1、動力曲線繪制：依據(jù)自動氨基酸分析儀測定所提供的數(shù)據(jù)，以酶解時間為橫坐標(biāo)，對不同時間所釋放的各種氨基酸相應(yīng)的量（mol/L）為縱坐標(biāo)作圖，繪制出氨基酸釋放的動力學(xué)曲線圖。2、C－末端分析結(jié)果：根據(jù)上述氨基酸釋放的動力學(xué)曲線分析，判斷和確定被測定蛋白質(zhì)的C-末端為何種氨基酸，并寫出其C－末端氨基酸排列順序。（四）實驗結(jié)果：53第五節(jié)氨基酸的定性測定一、氨基酸的一般顯色反應(yīng)（一）茚三酮法：常用法：將點有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用5g/L茚三酮無水丙酮溶液噴霧，充分吹干，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過高，避免空氣中氮，以免背泛紅色），氨基酸斑點呈紫紅色。第五節(jié)氨基酸的定性測定54（二）吲哚醌法：1、原理：各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辨認氨基酸。氨對吲哚鯤顯色沒有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在絕對干燥的環(huán)境中才能保存。2、試劑：顯色劑；底色退色劑。3、顯色步驟：（二）吲哚醌法：55（三）鄰苯二甲醛法：鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量，并推廣應(yīng)用于乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的檢出和定量。1、原理：鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為340nm和455nm。2、試劑：鄰苯二甲醛顯色液，巰基乙醇，三乙胺，丙酮，石油醚等。3、顯色步驟：將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中1min，冷風(fēng)吹干，在溫度18℃以下，濕度50％－90％之間顯色0.5h，于紫外燈下觀察熒光點。4、說明：顯色時必須有一定的濕度，以便氨基酸溶解。（三）鄰苯二甲醛法：56二、個別氨基酸的顯色反應(yīng)（一）精氨酸的顯色－坂口（Sakaguchi）反應(yīng)：1、第一種方法：試劑①：5g尿素溶解于100ml，0.1g/Lα－萘酚乙醇中，使用前，每100ml加約5gKOH；試劑②：0.7ml溴水溶解于100ml，5％NaOH中。顯色步驟：在點有樣品的濾紙上噴試劑①后，在空氣中吹幾分鐘，再噴試劑精氨酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對含精氨酸的蛋白質(zhì)也適用。2、第二種方法：試劑①：1g/L8-羥基喹啉的丙酮溶液；試劑②：0.02ml溴水溶解于100ml，5％NaOH中。顯色步驟：將點有樣品的濾紙烘干后，噴上試劑①，吹干后，再噴試劑②。精氨酸或其他胍類物質(zhì)顯橘紅色。二、個別氨基酸的顯色反應(yīng)57（二）胱氨酸和半胱氨酸的顯色：試劑①：1.5g亞硝基鐵氰化鈉溶于5ml，2mol/L硫酸溶液中，家95ml甲醇。使用時在每100ml上述溶液中加10ml28％氨水，過濾除去沉淀，清液僅能保持1d。試劑②：2g氰化鈉溶于5ml水中，然后加95ml甲醇。顯色步驟：半胱氨酸顯色：在濾紙上噴試劑①的清液，5min后半胱氨酸顯紅色。胱氨酸顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑①的清液，5min后胱氨酸顯紅色。（二）胱氨酸和半胱氨酸的顯色：58（三）甘氨酸的顯色：試劑：0.1g鄰苯二甲醛溶于100ml77％乙醇中。顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力棕色。吲哚醌顯色后，再用此試劑仍有效。（四）脯氨酸的顯色：試劑：1g吲哚醌和1.5g乙酸鋅、5ml蒸餾水混合，再加入95ml異丙醇。顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上試劑，80-85℃烘箱內(nèi)放置30min，脯氨酸顯藍色，再以30℃溫水漂洗除去多余的試劑后，背景為白色或淺黃色。（三）甘氨酸的顯色：59（五）絲氨酸和羥賴氨酸的顯色：試劑①：0.0345mol/L過碘酸鈉；試劑②：15g乙酸銨加0.3ml冰乙酸，加1ml乙酰丙酮，用甲醇稀釋到100ml。顯色步驟：點有樣品的濾紙吹干，先噴試劑①，快干時噴試劑②，室溫放置2h，紫外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點，在紫外線下都有熒光。（五）絲氨酸和羥賴氨酸的顯色：60（六）羥脯氨酸的顯色：試劑①：1g吲哚醌溶于100ml乙醇和10ml冰乙酸。試劑②：1g對二甲基氨基苯甲醛溶于100ml丙酮，濃鹽酸（9＋1）混合液中。顯色步驟：將待鑒定的溶于點于小方塊紙上，干后先點上試劑①，熱風(fēng)吹干。這時純羥脯氨酸呈墨綠色，春脯氨酸呈深藍色；然后再點上試劑②吹干，如溶液中含有羥脯氨酸即轉(zhuǎn)變?yōu)槊倒寮t色。（六）羥脯氨酸的顯色：61（七）色氨酸的顯色：1、第一種方法：試劑：1g對二甲氨基苯甲醛加90ml丙酮、10ml濃鹽酸。新鮮配制。顯色：點有樣品的濾紙干燥后，噴上試劑，在室溫下放置幾分鐘后，色氨酸顯藍色或紫紅色。2、第二種方法：試劑：10ml35％的甲醛加10ml25％鹽酸、20ml無水乙醇。顯色：點有樣品的濾紙噴上試劑后，100℃烘5min，色氨酸在波長紫外光下呈現(xiàn)熒光（黃－橙－帶綠色）。（七）色氨酸的顯色：62（八）酪氨酸的顯色：試劑①：0.1％α－亞硝基－β－萘酚的95％乙醇溶液。試劑②：10％硝酸水溶液。顯色：點有樣品的濾紙噴上試劑①后，吹干，再噴試劑②，然后在100℃烘3min，酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h后轉(zhuǎn)變?yōu)殚偌t色。（九）酪氨酸和組氨酸的顯色－pauly反應(yīng)：試劑①：4.5g對氨基苯磺酸與45ml，12mol/L鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500ml。試劑②：10％碳酸鈉水溶液。顯色：點有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻后再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多肽顯橘紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。（八）酪氨酸的顯色：63第六節(jié)氨基酸定量測定一、氨基酸的一般定量測定（一）甲醛滴定法：1、原理：氨基酸具有酸性羧基（-COOH）和堿性的氨基（-NH2），它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH，并用間接的方法測定氨基酸總量。2、方法特點及應(yīng)用：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測定）。3、試劑第六節(jié)氨基酸定量測定一、氨基酸的一般定量測定644、操作方法：吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，加入至標(biāo)線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，加入60ml，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，供計算總酸含量。加入10.0ml甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。同時取80ml蒸餾水置于另一個200ml潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至Ph8.2，再加入10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至Ph9.2，作為試劑空白實驗。4、操作方法：655、結(jié)果計算：式中：V1－樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點（Ph9.2）所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；V2－空白實驗加入甲醛后滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；c－氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；m－測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g；0.014－1/2N2的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。6、說明及注意事項：①此法適用于測定食品中的游離氨基酸；②混濁和色深樣液可不經(jīng)處理直接測定。5、結(jié)果計算：66（二）電位滴定法1、原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成原電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計指示的pH判斷滴定終點。（二）電位滴定法67（三）茚三酮比色法：1、原理：氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），可用吸光光度法測定。該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為570nm。故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量。（三）茚三酮比色法：682、儀器3、試劑4、操作方法：①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：②樣品測定：吸取澄清的樣品溶液1-4ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光值A(chǔ),據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得氨基酸質(zhì)量（μg）。5、結(jié)果計算：氨基酸含量＝m×100/(m1-1000)（mg/100g）式中：m－從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的氨基酸含量，μg；m1－測定的樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g。2、儀器696、說明及注意事項：①樣品處理：取樣5-10g或吸取樣液5-10ml，置于燒杯中，加入50ml蒸餾水和5g活性炭，加熱煮沸，過濾。用30-40ml熱水洗滌活性炭，收集濾液于100ml容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻備用。②茚三酮易氧化變色，使用前需進行純化處理。6、說明及注意事項：70（四）非水溶液滴定法：1、原理：氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰乙酸中用高氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈現(xiàn)中性，假如在冰醋酸中就顯示出堿性，因此可以用高氯酸等強酸進行滴定。本法適合于氨基酸成品的含量測定。允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸。2、試劑（四）非水溶液滴定法：713、操作方法：①直接法（適用于能溶解于冰乙酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg左右，溶解于20ml冰乙酸中，加2滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定（用10ml體積的微量滴定管），終點為紫色剛消失，呈現(xiàn)藍色。空白管為不含氨基酸的冰乙酸液，滴定至同樣的終點顏色。②回滴法（適用于不易溶解于冰乙酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品30-40mg，溶解于5ml，0.1mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加2滴甲基紫指示劑，剩余的酸以乙酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經(jīng)過綠、藍至初次出現(xiàn)不退的紫色為終點。3、操作方法：724、說明：①不易溶解于冰乙酸的氨基酸，但能溶于高氯酸可以用回滴法測定的氨基酸有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。②谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解于2ml加酸中，再加20ml冰乙酸，直接用標(biāo)準(zhǔn)的高氯酸溶液滴定。4、說明：73（五）鄰苯二甲醛法（OPA法）：鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為340nm和455nm。本法可用于游離氨基酸的測定，靈敏度較茚三酮法高100倍以上。不足之處：鄰苯二甲醛與脯氨酸不產(chǎn)生熒光，與半胱氨酸熒光值太低。（五）鄰苯二甲醛法（OPA法）：74（六）三硝基苯磺酸法：三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS在偏堿性的條件下與氨基酸反應(yīng)，先形成中間絡(luò)合物；中間絡(luò)合物在光譜上有2個吸收值相近的高峰，分別位于355nm和420nm附近。然而溶液一旦酸化，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成三硝基苯－氨基酸（TNP-氨基酸），420nm處的吸收值顯著下降，而350nm附近的吸收峰則移至340nm處。利用上述反應(yīng)特性，可在420nm處（偏堿性溶液中）或在340nm處（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。本法允許測定范圍是0.05-0.4μmol氨基酸。（六）三硝基苯磺酸法：75（七）乙酰丙酮和甲醛熒光法：1、原理：氨基酸與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)，生成N-取代基-2,6-二甲基-3,5-二乙酰基-1,4-二氫吡啶，產(chǎn)生黃－綠色熒光，可用熒光分析法檢測。2、試劑：混合試劑：取1mol/L乙酸鈉溶液10ml，加入乙酰丙酮溶液0.4ml和30％甲醛溶液1ml，用水稀釋至30ml。3、操作方法：取氨基酸液1ml，加入混合試劑1ml，用棉花塞滿試管口，避光于100℃下加熱10min，冷卻，加水2ml，然后測定熒光值。（七）乙酰丙酮和甲醛熒光法：76二、個別氨基酸的定量測定（一）賴氨酸的測定：1、原理：用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基，是賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4-二硝基苯（FDNB）反應(yīng)，生成ε-DNP-賴氨酸。經(jīng)酸化和用二乙基醚提取，在波長390nm處有吸收峰，從而求出樣品中游離賴氨酸的含量。2、試劑：氯化銅溶液；磷酸三鈉溶液；硼酸鹽緩沖液；磷酸銅懸浮液；1-氟-2,4-二硝基苯（FDNB）溶液；賴氨酸-HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液；100g/L丙氨酸溶液。二、個別氨基酸的定量測定773、測定：①稱取通過40目篩的均勻試樣1.00g，置于100ml燒瓶中。另吸取賴氨酸－HCl標(biāo)準(zhǔn)工作液5ml（相當(dāng)于1mg賴氨酸－HCl），連同試劑空白同時進行實驗。②向各燒瓶中加入25ml磷酸銅懸浮液，然后再加10％丙氨酸1.0ml，振搖15min吸取10％FDNB溶液0.5ml。置于各處理燒瓶中，將燒瓶置沸水中加熱15min。③取出燒瓶，立即加入1mol/L鹽酸溶液25ml，并不斷振搖使之酸化和分散均勻。④燒瓶中的溶液冷取至室溫，用水稀釋至100ml，取約40ml懸浮液進行離心。⑤用25ml二乙基醚提取上清液3次，除去醚。并將溶液收集于有刻度的試管中，于65℃水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。并記錄溶液的體積。3、測定：78⑥吸取上述各處理液10ml，分別于95％乙醇溶液10ml混合，用濾紙過濾。⑦用試劑空白液調(diào)零，測定樣液A390nm，與賴氨酸－HCl標(biāo)準(zhǔn)液對照，求出樣品中賴氨酸－HCl的含量。本法在0-40mg/L賴氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。4、說明：①添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸濃度，有助于賴氨酸－HCl濃度具有良好的線性關(guān)系。②用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDNB的產(chǎn)物破壞，否則這些產(chǎn)物在390nm處存在干擾。⑥吸取上述各處理液10ml，分別于95％乙醇溶液10ml混79（二）色氨酸的測定：1、原理：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生成哈爾滿化合物（nor-harman），具有特征熒光值，可以進行定量測定。2、試劑：0.3mmol/L三氯化鐵-三氯乙酸溶液；2％甲醛；色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。（二）色氨酸的測定：803、測定：稱取樣品粉末100～200mg于離心管中，加入4ml乙醚，搖勻后過夜，以3000r/min速度離心。將乙醚提取液移入試管中，并用乙醚洗滌殘渣3次，收集乙醚液于試管中，于40℃水浴中除去乙醚。殘留物中加入6.25mol/L氫氧化鈉4ml，火焰封口，于110℃水解16-24h。水解液用4mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)至ｐH6～8后，用水定容至50ml，過濾備用。吸取濾液0.2ml，加入2％甲醛0.2ml和0.3mmol/L三氯化鐵-三氯乙酸溶液2ml，搖勻后于100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻后用水定容至10ml。在激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長449nm條件下，測定樣品的熒光強度，與色氨酸標(biāo)樣對照，求出樣品中色氨酸含量。本法在0～10mg/L色氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。3、測定：81（三）苯丙氨酸的測定：1、原理：苯丙氨酸與茚三酮及銅鹽反應(yīng)生成熒光復(fù)合物，其熒光復(fù)合物在激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長490nm處可產(chǎn)生最大熒光強度，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸對照，可求出樣品中苯丙氨酸的含量，檢測時加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增強這一反應(yīng)。2、試劑：二肽-茚三酮試劑；銅試劑；0.6mol/L三氯乙酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)苯丙氨酸溶液。（三）苯丙氨酸的測定：823、操作方法：①血清的去蛋白處理：用三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)，離心除去。②樣品測定：吸取樣品液100μL，置于樣品管中，另吸取苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液25μL，加0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL，然后兩管均加入至200μL，同時作試劑空白分析。再向各管加入二肽－茚三酮0.3ml。放在75℃水浴中保溫80min。取出冷卻，加入2.5ml銅試劑，振搖均勻，90min內(nèi)在激發(fā)波長為385nm，發(fā)射波長472nm條件下，測定樣品的熒光值，與苯丙氨酸標(biāo)樣對照，求出樣品游離苯丙氨酸含量。3、操作方法：834、結(jié)果計算：式中：f1－檢樣熒光值；f2－標(biāo)樣熒光值；f0－試劑空白熒光值；m’－標(biāo)樣氨基酸質(zhì)量，mg；m－樣品質(zhì)量，mg。4、結(jié)果計算：845、說明：①反應(yīng)溫度、時間對熒光物質(zhì)的生成有顯著影響；②熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性：從保溫完畢加入銅試劑后算起，相對熒光值約穩(wěn)定90min；③苯丙氨酸和茚三酮、銅鹽作用的產(chǎn)物如果沒有二肽存在幾乎沒有熒光產(chǎn)生。④反應(yīng)溶液的pH值低于5.8，產(chǎn)生的熒光較低，pH大于5.8則熒光增強，在pH6.8時達到最高值，但專一性下降。5、說明：85（四）酪氨酸的測定：1、原理：酪氨酸和1-亞硝酸-2-萘酚反應(yīng)，生成有色化合物，此化合物在硝酸和亞硝酸鈉存在的條件下加熱，產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，可用熒光法定量測定。2、試劑：亞硝酸-萘酚試劑；0.6mol/L三氯乙酸溶液；1,2-二氯乙烷；標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液（7.2mg/L）。（四）酪氨酸的測定：863、測定：①樣品去蛋白處理：三氯乙酸溶液沉淀蛋白，離心去除。②樣品測定：分別吸取樣液100μL于具塞試管1；標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液25μL和0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL于具塞試管2；0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL于具塞試管3；各管用水補充容積至200μL。將各管置于55℃水浴數(shù)分鐘，加入新配制的亞硝酸萘酚試劑0.3ml，搖勻，55℃保溫20min，保溫后加水2.5ml，搖勻后加入三氯乙酸溶液3ml。充分振蕩以便使多余的試劑抽提入二氯乙烷溶液中，4000r/min離心10min，將上層水溶液移至另一個試管內(nèi)，在180min內(nèi)，于激發(fā)波長468nm，發(fā)射波長555nm處，測定樣品的熒光強度，與氨基酸標(biāo)樣對照，求出樣品氨基酸含量。4、說明：①熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性：從保溫完畢開始，相對熒光值在180min內(nèi)平均減少2％；②酪胺的存在對熒光強度測定存在干擾。3、測定：87（五）脯氨酸的測定：1、原理：在丙酮溶劑中，脯氨酸與吲哚醌反應(yīng)形成藍色化合物，能用以測定蛋白質(zhì)水解液中的脯氨酸含量，在一定條件下（包括pH、緩沖液濃度和吲哚鯤濃度），可以在其他氨基酸存在下直接進行測定，不受羥脯氨酸的干擾。2、試劑：pH3.9的檸檬酸鹽緩沖液；0.75g/L吲哚醌丙酮溶液；水飽和酚溶液。（五）脯氨酸的測定：883、測定：稱取蛋白質(zhì)樣品5mg，加6mol/LHCl溶液2ml，封管后于140℃水解4h。啟封，加蒸餾水稀釋至鹽酸濃度達0.25mol/L。吸取含一定量蛋白質(zhì)酸水解液0.1-0.5ml于小燒杯中，75℃干燥至恒重。殘留物加pH3.9檸檬酸鹽緩沖液0.2ml，使殘留物完全溶解后，加0.75g/L吲哚醌丙酮溶液0.25ml，混勻，于100℃烘箱內(nèi)使溶劑蒸發(fā)0.5h左右。以下步驟在避光條件下操作。先加0.5ml水飽和酚溶液，劇烈搖動后，加1ml蒸餾水和2ml丙酮，混勻成均相溶液，立即在波長598nm處，以試劑空白調(diào)零，測定樣品A598nm，與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)對照，求出樣品中脯氨酸含量。本法在0-10mg/L氨基酸溶液范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。4、說明：①要獲得最佳的靈敏度及專一性，必須嚴(yán)格控制實驗條件，即緩沖液濃度，pH值和吲哚醌濃度。②脯氨酸與吲哚醌形成的藍色化合物見光不穩(wěn)定，必須避光操作。3、測定：89（六）羥脯氨酸的測定：1、原理：羥脯氨酸在有過量丙氨酸（其作用是減少其他氨基酸的干擾）的條件下，用氯胺T氧化生成△’-吡咯啉-4-羥基-2-羧酸和吡咯-2-羧酸，它們不溶于甲苯，但將溶液加熱處理后可溶于甲苯中。所以在加熱前先用甲苯除去其他物質(zhì)，加熱后再用甲苯把這些氧化產(chǎn)物抽提，最后用對-二甲基苯甲醛試劑顯色，在波長560nm處有最大吸收值，可進行定量測定。2、試劑：（六）羥脯氨酸的測定：903、測定；酸水解：氧化和抽提：樣品測定：4、說明：①本法對羥脯氨酸有特異性，其他氨基酸即使同時存在10000倍也無干擾。②如測定游離羥脯氨酸可省去第一步酸水解操作。3、測定；91（七）胱氨酸的測定：1、原理：用亞硫酸鹽使胱氨酸還原為半胱氨酸和S-半胱氨酸磺酸，其他含二硫鍵的物質(zhì)也被還原。通過巰基被磷鎢酸還原成鎢藍的反應(yīng)測定半胱氨酸，從而定量出胱氨酸。非胱氨酸的巰基可在加磷鎢酸前先加氯化汞與巰基結(jié)合。因反應(yīng)pH為5，其他還原性物質(zhì)如尿酸、抗壞血酸也使磷鎢酸還原，通過空白對照加以去除。2、試劑：（七）胱氨酸的測定：923、測定：①取4支試管分別吸取：ａ.測定管：樣品液1.0ml（胱氨酸含量0.2mg／mL）；ｂ.樣品空白管：樣品液1.0ml；ｃ.標(biāo)準(zhǔn)管：胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液0.5ml，蒸餾水0.5ml；ｄ.試劑空白管：蒸餾水1.0ml。②胱氨酸的還原反應(yīng)：上述各管分別加入乙酸鹽緩沖液1.0ml，亞硫酸鈉試劑0.3mL。測定管和標(biāo)準(zhǔn)管各加入蒸餾水1.7ｍｌ；樣品空白管和試劑空白管各加蒸餾水1.5mL、0.1mol／L氯化汞溶液0.2ml，混合后放置2min。3、測定：93③巰基的還原反應(yīng)和顯色：上述各管分別加磷鎢酸試劑1.0mL，混合后于15min內(nèi)，在600nm波長下，以試劑空白管校正零點，測定標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；以樣品空白管校正零點，測定樣品測定管吸光度，與氨基酸標(biāo)樣作對照，求出樣品氨基酸含量。本法在0-200mg/L氨基酸范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。4、說明：如果測定樣品中有胱氨酸結(jié)晶時，可用離心方法把沉淀物分離。然后向沉淀物中加1mol/LHCl溶液1.0mL，在60℃水浴中保溫15min，使胱氨酸溶解。再離心后，取此上清液與初次離心上清液合并進行分析。③巰基的還原反應(yīng)和顯色：上述各管分別加磷鎢酸試劑1.0mL94（八）谷氨酸的測定：1、原理：L－谷氨酸在大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶作用下脫羧釋放出二氧化碳，用壓法測得二氧化碳放出量，計算出谷氨酸含量。2、試劑：大腸桿菌丙酮粉的制備；0.5mol/LpH4.8乙酸鹽緩沖液；20g／L大腸桿菌丙酮粉