微弧氧化法制備i-ail-4v載銀多孔涂層的研究

微弧氧化法制備i-ail-4v載銀多孔涂層的研究

生物材料的長(zhǎng)期應(yīng)用將導(dǎo)致細(xì)菌和其他微生物在其表面上的粘附和感染。這種感染被稱為“生物材料感染（bci）”[1.5]。隨著人工關(guān)節(jié)和牙種植體等人體植入類醫(yī)療器械的廣泛應(yīng)用,通過醫(yī)用器件產(chǎn)生的細(xì)菌感染性疾病已經(jīng)成為臨床各科室關(guān)注的重要問題之一[6~8]。BCI不僅發(fā)生率高,更重要的是,發(fā)生BCI后,會(huì)引起愈合不良,甚至導(dǎo)致死亡。BCI現(xiàn)象的發(fā)生,不僅給人類帶來(lái)了嚴(yán)重的健康威脅和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而且在一定程度上限制了生物醫(yī)用材料的應(yīng)用和發(fā)展。鈦合金憑借其優(yōu)良的生物相容性、耐腐蝕性和綜合力學(xué)性能逐漸成為牙種植體、骨創(chuàng)傷產(chǎn)品及人工關(guān)節(jié)等人體硬組織替代物和修復(fù)物的首選材料[11~13]。但生物醫(yī)用鈦及其合金植入材料植入人體后,同樣會(huì)遇到BCI問題。比如用于人工心臟瓣膜引起的早期人工瓣膜心內(nèi)膜炎,用于口腔種植體引起的牙周炎等口腔炎癥。更嚴(yán)重的是,為了有利于骨整合,植入材料表面一般設(shè)計(jì)為具有一定粗糙度的表面,這樣就為細(xì)菌的黏附提供了有利的條件,增加了感染發(fā)生的概率。一旦感染發(fā)生,不僅會(huì)增加病人住院治療費(fèi)用,而且有時(shí)需要取出內(nèi)植物重新手術(shù),甚至面臨截肢、死亡等危險(xiǎn)。因此,如何有效預(yù)防醫(yī)用鈦合金材料相關(guān)的感染(BCI),已經(jīng)成為生物醫(yī)用材料和臨床醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域所面臨的重要問題,具有重要的臨床實(shí)際意義。BCI的最初過程是生物材料表面的細(xì)菌黏附,一旦發(fā)生BCI,治療效果極差。因此,為了減少BCI的發(fā)生,一方面應(yīng)減少細(xì)菌的污染,這包括在植入生物材料之前,徹底地治愈慢性感染病灶,植入生物材料過程中和術(shù)后,嚴(yán)格的無(wú)菌觀念和預(yù)防性地應(yīng)用抗菌素。另一方面則應(yīng)改進(jìn)和完善生物材料的性能,其中最有效的方法之一是對(duì)醫(yī)用鈦合金進(jìn)行表面改性處理[14~20]。為提高抗菌效果和延長(zhǎng)抗菌時(shí)間,實(shí)驗(yàn)在微弧氧化(micro-arcoxidation,MAO)之前采用250V低電壓MAO法制備TiO2預(yù)涂層,AgNO3溶液浸泡并紫外光輻射處理后,再在含銀電解液中采用二次MAO對(duì)樣品進(jìn)行處理,即通過兩步MAO法制備載銀多孔抗菌涂層。1材料和方法1.1研磨法制備砂紙實(shí)驗(yàn)樣品為Φ10mm×2mm的Ti-6Al-4V鈦合金圓片,表面依次經(jīng)600、800、1000、1200號(hào)砂紙打磨平整后,再在金相拋光機(jī)上拋光至鏡面,最后依次在丙酮、去離子水和無(wú)水乙醇中超聲波清洗30min后烘干備用。1.2方法1.2.1預(yù)涂層ti-aal-4v的合成通法采用WHD-30型MAO系統(tǒng)制備預(yù)涂層,Ti-6Al-4V樣品片為陽(yáng)極,以不銹鋼為陰極,采用恒壓模式,正向電壓250V,無(wú)負(fù)向電壓,頻率100Hz,占空比30%,處理時(shí)間5min。獲得預(yù)涂層Ti-6Al-4V樣品。電解液配比為:β-甘油磷酸鈉0.01mol/L,乙酸鈣0.08mol/L。氧化處理后將樣品依次經(jīng)蒸餾水超聲清洗、室溫干燥,然后將樣品浸入到濃度1mol/LAgNO3溶液浸泡一定時(shí)間,再經(jīng)紫外光照射3~5h,紫外光中心波長(zhǎng)為253.7nm。獲得MAO250-Ag預(yù)涂層Ti-6Al-4V樣品。1.2.2納米銀改性的案例載銀預(yù)涂層樣品進(jìn)行二次MAO處理,電解液組成為:β-甘油磷酸鈉濃度0.02mol/L,乙酸鈣濃度0.16mol/L,納米銀濃度為0.2mol/L。工藝參數(shù):恒壓模氏,電壓為350V,頻率100Hz,占空比35%,處理時(shí)間5min。獲得MAO250-Ag-MAO涂層Ti-6Al-4V樣品。1.2.3涂層表面形貌及成分分析將制得的樣品采用JSF-6700掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)觀察其表面微觀形貌,并采用能量分散譜儀(energydispersiveX-rayspectrometer,EDS)檢測(cè)涂層成分。1.2.4實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和安全管理為驗(yàn)證涂層的抗菌能力,選用最常見的金黃色葡萄球菌菌株(Staphylococcusaureus,ATCC6538,第6代培養(yǎng)物)驗(yàn)證其抗菌能力,實(shí)驗(yàn)在符合GB19489規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和安全管理規(guī)定條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分為2組,一組為MAO250-Ag-MAO涂層材料樣品作實(shí)驗(yàn)組,另一組為無(wú)銀普通MAO涂層材料樣品作對(duì)照組,將菌液滴在樣品表面,在37℃、相對(duì)濕度95%、避光條件下培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為7d,并在細(xì)菌接種培養(yǎng)1、4、7d后對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行菌液一定倍率稀釋、培養(yǎng),進(jìn)行活菌落計(jì)數(shù),具體操作流程參考GB/T21866-2008及GB4789.2-2010進(jìn)行,并依以下公式計(jì)算抑菌率:抑菌率=(對(duì)照樣菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)樣菌落數(shù))/對(duì)照樣菌落數(shù)。1.3異常值的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用MinitabTM(Minitab公司,美國(guó))軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用格拉布斯檢驗(yàn)方法去除異常值。對(duì)正態(tài)分布結(jié)果采用Anderson-Darling法驗(yàn)證,采用方差分析(ANOVA,SAS公司,卡里,NC)對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1多孔形分布對(duì)250V低電壓MAO預(yù)涂層通過SEM進(jìn)行觀察,可發(fā)現(xiàn)其微觀形貌是典型的MAO形貌,表面呈多孔狀,孔洞呈火山口形(圖1)。采用ImageJ對(duì)放大1000倍和3000倍SEM圖片進(jìn)行處理和數(shù)據(jù)采集,對(duì)孔徑和孔隙率進(jìn)行測(cè)算,2種倍數(shù)下獲得的數(shù)據(jù)相似度較高,對(duì)2份數(shù)據(jù)取算術(shù)平均值,250V低電壓MAO預(yù)涂層平均孔徑0.71μm,屬亞微米級(jí),孔隙率為11.1%。2.2預(yù)涂層印銀顆粒的微觀形貌將制備得的預(yù)涂層Ti-6Al-4V樣品浸入到濃度為1mol/LAgNO3溶液中浸泡2h,并經(jīng)紫外線輻射處理,得到的MAO250-Ag涂層Ti-6Al-4V樣品預(yù)涂層微觀SEM形貌(圖2)。從照片中可以發(fā)現(xiàn),在載銀預(yù)涂層表面附著有大量白亮的含銀顆粒,如圖中箭頭處所示,部分微孔內(nèi)壁處較為白亮,可能是微孔的邊緣處含銀顆粒分布較多而密集導(dǎo)致。250V低電壓MAO載銀后經(jīng)二次MAO處理后獲樣品微觀形貌的SEM照片(圖3)。由圖中可見,由250V低電壓MAO載銀(MAO250-Ag)預(yù)涂層制備得到的MAO250-Ag-MAO涂層微觀形貌與MAO-250-Ag預(yù)涂層的無(wú)明顯差別,均為多孔形貌,且孔洞呈火山口形,涂層表面和孔洞處散布有少量微小白色顆粒,分析即為含銀顆粒,與MAO250-Ag預(yù)涂層相比較,由于其提高了氧化電壓,部分孔洞直徑明顯增大,經(jīng)ImageJ軟件測(cè)算,平均孔徑約為1.57μm,稍大于MAO250-Ag預(yù)涂層平均孔徑,并且部分孔洞間有細(xì)小裂紋連接。2.3涂層中ti和o元素含量在載銀涂層樣品表面隨機(jī)選取80μm×80μm左右的區(qū)域進(jìn)行選區(qū)EDS檢測(cè)(圖4),結(jié)果表明涂層中主要含有Ti和O元素,質(zhì)量百分比分別為48.06%和38.67%。同時(shí)含有質(zhì)量百分比為3.75%的Ca和1.17%的P,而Ag元素的平均質(zhì)量百分比為8.35%,分析認(rèn)為載銀預(yù)涂層和二次MAO膜提供的微孔洞為銀在涂層表面和內(nèi)部的大量固定提供了條件。2.4菌落計(jì)數(shù)及抗菌性能分析為驗(yàn)證載銀涂層的抗菌活性,按照前文確定的工藝制備載銀涂層,并采用平板涂布法測(cè)定其抗菌能力。將菌液滴加在MAO250-Ag-MAO涂層材料的實(shí)驗(yàn)組和無(wú)銀普通MAO材料的對(duì)照組樣品表面培養(yǎng)1、4、7d,之后將培養(yǎng)液稀釋1000倍,加入吐溫80表面活性劑分散均勻后繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)其進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),為獲得穩(wěn)定準(zhǔn)確數(shù)據(jù),每組數(shù)據(jù)設(shè)置3個(gè)平行樣品,分別標(biāo)為樣品1、2、3,菌落計(jì)數(shù)后取其平均值。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組稀釋后菌落生長(zhǎng)情況見圖5所示。通過ImageJ圖像識(shí)別軟件輔助計(jì)數(shù),計(jì)算2組的抗菌率?？梢?組樣品數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定,未出現(xiàn)較大偏差(P>0.05),說明數(shù)據(jù)可靠性高,對(duì)其取均值后確定MAO250-Ag-MAO涂層材料在1、4、7d的抗菌率分別達(dá)到96.94%、81.35%和71.27%。說明MAO250-Ag-MAO涂層材料與無(wú)銀普通MAO涂層材料對(duì)照樣品相比有顯著高效的抑菌能力。其抗菌能力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱,這與銀離子釋放速率測(cè)試結(jié)果基本對(duì)應(yīng)一致,但在7d后仍可殺滅細(xì)菌總量的70%以上,說明有較好的長(zhǎng)期抗菌能力。3載銀多孔涂層的抗菌性能MAO作為醫(yī)用鈦合金表面改性的一種有效手段廣泛應(yīng)用于硬組織植入或修復(fù)類器械的表面活性處理,該方法不僅可將電解液中元素引入涂層,還可在基體表面形成多孔涂層,多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞和骨組織的長(zhǎng)入。文獻(xiàn)報(bào)道,350V及更高電壓下獲得的平均孔徑為2~3μm,筆者通過低電壓MAO得到的平均孔徑為0.71μm,說明MAO250預(yù)涂層在該工藝條件下成功地獲得了孔徑較小的多孔形貌,更小的孔徑可獲得更大的比表面積,這有利于吸附更多的銀元素。多孔涂層表面部分孔洞間存在少量細(xì)小裂紋。分析認(rèn)為MAO250預(yù)涂層是在250V電壓下獲得,此時(shí)預(yù)涂層阻值高、厚度較大,在氧化處理時(shí)就需要更高的電壓才能擊穿,電弧擊穿原有預(yù)涂層時(shí)的瞬間電壓已達(dá)較高值,電弧攜帶能量大,形成對(duì)已有膜層的破壞,導(dǎo)致裂紋。此外膜層在干燥過程中和內(nèi)應(yīng)力的作用下也會(huì)產(chǎn)生微裂紋。銀元素具有廣譜抗菌性能,且不易產(chǎn)生耐藥性。但傳統(tǒng)的物理吸附法易造成銀元素植入初期大量釋放,抗菌作用時(shí)間短。而單純的MAO難以實(shí)現(xiàn)較大量銀離子在生物材料表面的固定,即抗菌效果不理想。筆者通過兩步MAO處理,不僅可實(shí)現(xiàn)較大量銀元素在鈦合金材料表面的引入,還可通過擴(kuò)散、離子交換、溶出等過程實(shí)現(xiàn)銀元素平穩(wěn)、長(zhǎng)期的釋放?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)筆者制得的載銀多孔涂層具有良好的短期抗菌效果,并能保持較長(zhǎng)的抗菌作用時(shí)間,這不僅源于涂層中銀元素的質(zhì)量百分比較大,還由于筆者采用銀/二氧化鈦復(fù)合無(wú)機(jī)抗菌劑在Ti-6Al-4V合金基體表面形成抗菌層。圖4的EDS檢測(cè)結(jié)果表明,涂層主要由二氧化鈦構(gòu)成,二氧化鈦本身即具有抗菌效果,銀離子的載入可以與二氧化鈦形成協(xié)同效應(yīng),對(duì)需氧菌和口腔常見致病菌細(xì)菌均具有很好的抗菌效果,并對(duì)口腔常見致病菌有抗黏附作用,進(jìn)而大幅提高基體的抗菌性能和適應(yīng)范圍。此外筆者所制備的抗菌復(fù)合涂層為多孔涂層,二氧化鈦的光催化效能很大程度上與其表面所形成的活性氧的多少有關(guān),光催化劑覆蓋的面積越大