內(nèi)異康復(fù)栓直腸給藥對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠cyc、survilin表達(dá)的影響

內(nèi)異康復(fù)栓直腸給藥對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠cyc、survilin表達(dá)的影響

子宮內(nèi)膜組（pmt）引起的疼痛、妊娠、慢性骨盆疼痛和性交痛嚴(yán)重影響了女性的生殖健康和生活質(zhì)量。它被稱為良性癌癥。本病具有類似惡性腫瘤的侵襲性、種植性和復(fù)發(fā)性,因此推測(cè)EMT的發(fā)生可能與凋亡調(diào)控基因有關(guān)。子宮內(nèi)膜細(xì)胞自發(fā)性凋亡是內(nèi)膜組織保持正常結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因素,而凋亡異?？纱龠M(jìn)EMT的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞色素C(cytochromeC,cytC)是線粒體啟動(dòng)凋亡程序的關(guān)鍵物質(zhì)之一,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用;生存素(Survivin)屬凋亡抑制蛋白家族的一員。內(nèi)異康復(fù)栓具有清濕化瘀、行氣止痛、消癥散結(jié)之功效,經(jīng)直腸給藥治療EMT具有較好療效。本實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)異康復(fù)栓進(jìn)行療效機(jī)理的研究,采用免疫組化SP法檢測(cè)內(nèi)異康復(fù)栓直腸給藥對(duì)cytC和Survivin在EMT大鼠異位、在位子宮內(nèi)膜表達(dá)的影響。材料和方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及膜質(zhì)健康性成熟未交配過的雌性SD大鼠45只,體重180~250g,清潔級(jí)動(dòng)物,由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第8號(hào),批號(hào):SCXK(川)2004-11。2其他藥品內(nèi)異康復(fù)栓浸膏:由大血藤(Coulissargentodoxae)、丹參、三棱、土鱉蟲等組成,成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供(批號(hào):050928);丹莪婦康煎膏:由紫丹參、莪術(shù)、竹葉柴胡、三七、赤芍、當(dāng)歸、三棱、香附、延胡索、甘草組成,昆明滇虹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào):050503);丹那唑膠囊:上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào):050301)。3robcoligg2b的合成一抗購(gòu)自SantaCruzBiotechnology,INC公司:Survivin(FL-142)rabbitpolyclonalIgG,200μg/mL;cytochromeC(A-8)mousemonoclonalIgG2b200μg/mL;二抗及相應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。4圖像分析系統(tǒng)光學(xué)顯微鏡,型號(hào):BH-2;數(shù)碼攝像機(jī),型號(hào):TK-C1381EG;BIOMIAS圖像分析系統(tǒng);切片機(jī),型號(hào):AO.802;切片漂烘控溫儀,型號(hào):QO-B;脫水機(jī),型號(hào):TS-12G;包埋機(jī),型號(hào):BMJ-3。5內(nèi)異康復(fù)栓浸膏組模型組采用自體移植法建立EMT大鼠模型,30天后隨機(jī)抽取動(dòng)物剖腹證實(shí)模型成功后,隨機(jī)分為內(nèi)異康復(fù)栓高劑量[4.0g/(kg·d)],內(nèi)異康復(fù)栓低劑量組[2.0g/(kg·d)],丹那唑組[0.2g/(kg·d)],丹莪婦康煎膏組[10.0g/(kg·d)],模型組和空白組。內(nèi)異康復(fù)栓浸膏高、低劑量組直腸給藥,丹莪婦康煎膏組和丹那唑組灌胃給藥,模型組和空白組灌腸與內(nèi)異康復(fù)栓高、低劑量組等容積的生理鹽水。直腸給藥前輕輕按摩并擠壓大鼠肛門周圍,促使直腸內(nèi)積存的糞便排出,然后將直腸給藥針頭輕輕插入大鼠直腸約4.5cm,將藥液緩緩?fù)迫?同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的狀態(tài),給藥后觀察30min,若有藥液排出,即予補(bǔ)量。造模后30天開始給藥,持續(xù)給藥30天。6灶內(nèi)膜組織和瞳檢組織于末次給藥后24h脫頸椎處死大鼠,立即剖腹取異位病灶內(nèi)膜組織和在位子宮送檢。依據(jù)造模后病理組織形態(tài)學(xué)檢查抽樣結(jié)果,選取左側(cè)子宮中段旁腸系膜異位內(nèi)膜病灶及同側(cè)子宮中段作為標(biāo)本,置于10%中性福爾馬林液中固定,送檢。7免疫組化染色將剖腹取出的異位種植內(nèi)膜組織和左子宮(非手術(shù)側(cè))置于10%中性福爾馬林液中固定,48h后取出,經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(片厚4μm),采用免疫組化SP法染色。采用Mias圖形分析系統(tǒng),在200倍視野下,分別選擇在位內(nèi)膜組織的腺體中和異位內(nèi)膜組織的被覆上皮含陽性物質(zhì)(即棕黃色顆粒物質(zhì))最多的5個(gè)區(qū)域觀察,測(cè)定cytC和Survivin的表達(dá)[積分光密度(Integralopticaldensity,IOD)值]。8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,定量指標(biāo)取對(duì)數(shù)后用單因素方差分析,組間比較用LSD、S-N-K分析和Tamhane’sT2檢驗(yàn)。結(jié)果1各組正常組織形態(tài)變化異位內(nèi)膜:模型組子宮內(nèi)膜形成環(huán)形封閉式結(jié)構(gòu),較在位內(nèi)膜稍薄,宮腔被覆上皮呈假?gòu)?fù)層,部分呈復(fù)層排列,細(xì)胞擁擠,呈柱狀,血管豐富;各治療組異位內(nèi)膜腺上皮變薄,呈單層排列,細(xì)胞呈低柱狀甚至扁平狀松散排列,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,間質(zhì)細(xì)胞明顯減少,甚至缺如,周圍血管少。在位內(nèi)膜:模型組腺體數(shù)目與空白組接近,腺上皮細(xì)胞立方狀,排列較緊密,間質(zhì)細(xì)胞呈梭狀,排列緊密;各中藥治療組在位內(nèi)膜腺體數(shù)目和腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞與空白對(duì)照組比較無明顯改變;丹那唑組在位內(nèi)膜腺體數(shù)目減少,有的腺腔消失,腺上皮細(xì)胞呈低柱狀或扁平,排列稀疏,核小,染色淺,胞漿稀少,間質(zhì)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀,排列稀疏,染色淺。2原位cytc表達(dá)的變化與模型組比較,內(nèi)異康復(fù)栓高、低劑量組異位內(nèi)膜cytC的表達(dá)均顯著增加(P<0.01);Survivin表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01)。3各組大鼠載體cytc表達(dá)比較與模型組比較,內(nèi)異康復(fù)栓高、低劑量組能顯著上調(diào)模型大鼠在位內(nèi)膜下降的cytC水平(P<0.05),與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);丹那唑組與空白組及內(nèi)異康復(fù)栓高、低劑量組比較,大鼠在位內(nèi)膜cytC表達(dá)顯著增加(P<0.05)。內(nèi)異康復(fù)栓高、低劑量組大鼠在位內(nèi)膜Survivin表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì),與模型組和空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同模型大鼠體外凋亡的影響EMT是一種始于細(xì)胞水平而終止于以盆腔疼痛和不孕為特點(diǎn)的持續(xù)性病變,其發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚,目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,本病可能是一種在免疫及細(xì)胞凋亡異?；A(chǔ)上發(fā)生經(jīng)血逆流而導(dǎo)致的綜合結(jié)果,因其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,臨床上尚無有效的根治措施。凋亡是子宮內(nèi)膜細(xì)胞保持周期性結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的關(guān)鍵因素,異位內(nèi)膜細(xì)胞得以在宮腔外種植并繼續(xù)存活,與其對(duì)凋亡的抵抗力增強(qiáng)有關(guān)。cytC是呼吸鏈中的一個(gè)基本成分,在細(xì)胞氧化還原和能量代謝中起著重要的作用,同時(shí)cytC又是線粒體啟動(dòng)凋亡程序的關(guān)鍵物質(zhì)之一,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。cytC與bcl-2家族關(guān)系密切,bcl-2家族成員可通過對(duì)線粒體膜和cytC釋放的調(diào)節(jié),調(diào)控細(xì)胞的凋亡。cytC可通過對(duì)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大作用調(diào)控細(xì)胞凋亡,cytC與EMT的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)還鮮見報(bào)道。Survivin是一種關(guān)鍵性的凋亡抑制蛋白,是近年研究的熱點(diǎn),主要通過直接或間接與caspase相互作用來抑制細(xì)胞凋亡。Survivin可能通過抑制cytC的釋放在線粒體水平參與抗凋亡。研究表明,Survivin在異位內(nèi)膜組織的表達(dá)顯著高于在位內(nèi)膜,認(rèn)為其促進(jìn)了EMT的發(fā)生和侵襲性。Ueda等研究發(fā)現(xiàn)Survivin在異位病變組織和EMT的在位內(nèi)膜組織中表達(dá)比正常子宮內(nèi)膜組織高,提示Survivin上調(diào)與EMT的浸潤(rùn)和生長(zhǎng)呈正相關(guān)。目前Survivin與EMT相關(guān)的中醫(yī)藥研究文獻(xiàn)報(bào)道極少,尚處于探索階段。EMT屬于中醫(yī)“痛經(jīng)”、“癥瘕”、“不孕癥”等病證范疇。瘀血內(nèi)阻是產(chǎn)生EMT癥狀和體征的關(guān)鍵,濕熱瘀結(jié)也是EMT的主要病機(jī)之一,是病情纏綿難愈,反復(fù)發(fā)作的病理基礎(chǔ)。內(nèi)異康復(fù)栓以“濕熱瘀結(jié)”立論,處方由大血藤、丹參、三棱、土鱉蟲等組成,功效清濕化瘀、行氣止痛、消癥散結(jié)。由于EMT的病變主要在盆腔局部,栓劑直腸給藥可使藥物“直達(dá)病所”,避免了肝臟的“首過效應(yīng)”,可獲得理想的治療效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)異康復(fù)栓高、低劑量組均顯著增加模型大鼠異位內(nèi)膜cytC的表達(dá)并降低Survivin的表達(dá);內(nèi)異