紅豆杉抗癌活性組分的提取分離與口服結(jié)腸靶向制劑處方優(yōu)化

紅豆杉抗癌活性組分的提取分離與口服結(jié)腸靶向制劑處方優(yōu)化惡性腫瘤是繼心血管疾病之后發(fā)病率和病死率很高的疾病，嚴重威脅著人類的健康。而結(jié)腸癌是近年來常見惡性腫瘤中增長率最大的疾病之一。目前使用的化療藥物存在諸如免疫抑制、骨髓抑制等嚴重損害患者免疫系統(tǒng)的毒副作用，很難改善患者的生存質(zhì)量。近年來，中醫(yī)藥在抗腫瘤治療方面研究的比較多，天然藥物在抗腫瘤方面越來越發(fā)揮出其毒副作用小，來源方便的獨特優(yōu)勢。在暢銷的抗腫瘤植物藥中，從紅豆杉中提取的紫杉醇在腫瘤的治療上起著舉足輕重的作用。紫杉醇繼治療卵巢癌取得顯著療效之后，又被發(fā)現(xiàn)對于結(jié)腸癌也具有良好的治療作用，但紅豆杉中抗癌活性成分的研究多年來的研究走的一直是西藥化的路線，制得的純品價格昂貴，副作用大。紫杉醇多以注射劑為主要劑型，但紅豆杉植物中還含有大量其他抗癌活性物質(zhì)，由于不允許它們進入注射劑，在提取分離過程中只得將其作為雜質(zhì)棄去，非?？上Ш屠速M。本實驗以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，提取了云南紅豆杉枝葉中抗癌有效組分，旨在克服只依靠紫杉醇單體為有效成分所造成的一系列問題，其中的其他紫杉烷類化合物及總黃酮，總木脂素，生物堿等都在一定程度上有抗腫瘤作用，與紫杉醇配伍后，可發(fā)揮中藥的多成分多靶點的獨特優(yōu)勢，通過多方面途徑提高藥物療效，并且減低紫杉醇的毒副作用，紅豆杉資源緊缺，其他組分同時配伍使用還可以最大限度地利用其所含的其他有效成分，節(jié)省資源，降低產(chǎn)品價格。研究表明，紅豆杉屬植物中含有的多種有益組分，對結(jié)腸癌細胞亦有協(xié)同的藥理作用。紅豆杉有效成分多難溶于水，口服后不易被吸收，采用固體分散體，可增加藥物的溶出度；結(jié)腸的靶向制劑對于須經(jīng)大腸給藥治療的疾病具有特殊的意義，制成直腸的靶向給藥系統(tǒng)，可將藥物直接送到結(jié)腸部位，達到治療作用，提高生物利用度。目的：1.對國內(nèi)外有關(guān)紅豆杉以及紅豆杉中主要有效成分紫杉醇和其他相關(guān)物質(zhì)的研究文獻資料進行分類綜述；對有關(guān)結(jié)腸癌疾病的文獻進行總結(jié)，對固體分散技術(shù)和結(jié)腸靶向技術(shù)的國內(nèi)外研究情況進行綜述，對目前紅豆杉制劑的主要研究概況加以合理的分析。2.建立抗癌活性組分的含量測定方法。3.考察紅豆杉的基源和用藥部位，以及影響云南紅豆杉枝葉質(zhì)量的主要因素，以保證原料藥材的質(zhì)量，提高原料的利用率，為科學(xué)制定云南紅豆杉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供可以參考的理論依據(jù)。4.依次對云南紅豆杉枝葉進行提取工藝研究；初步除雜工藝研究；過柱精制工藝的研究，以改革傳統(tǒng)的提取分離工藝，使其更加適合大生產(chǎn)，提高紫杉烷類化合物的轉(zhuǎn)移率。5.研究紅豆杉提取物對體外結(jié)腸癌細胞的抑制作用，制定提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。6.制備提取物的腸溶固體分散體，并進一步制成微丸。7.對腸溶微丸進行評價和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。方法：1.將計算機檢索、手工追溯檢索等手段相結(jié)合，充分利用CA、BP、MEDLARS、CBM-Disc、CNKI數(shù)字圖書館全文數(shù)據(jù)庫、CMCC中文生物醫(yī)學(xué)期刊文獻數(shù)據(jù)庫、互聯(lián)網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，廣泛查閱有關(guān)紅豆杉資源及研究進展，主要化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，提取分離方法，藥理與臨床，制劑與商品等資料；查閱結(jié)腸癌的發(fā)病概況、診斷要點、病因病機及治療和預(yù)防；查閱結(jié)腸靶向制劑的生理學(xué)基礎(chǔ)，結(jié)腸吸收及劑型分類。2.采用高效液相色譜法對云南紅豆杉枝葉中紫杉烷類化合物進行含量測定，并進行方法學(xué)的考察。采用紫外分光光度法對總黃酮類成分進行含量測定，并進行方法學(xué)的考察。3.以紫杉烷類化合物含量為主要指標(biāo)，采用固相萃取法精制樣品，評價不同基源紅豆杉的質(zhì)量，云南紅豆杉不同用藥部位以及不同生長年限和貯藏時間對云南紅豆杉枝葉質(zhì)量的影響。4.以總萜得率，提取物中紫杉烷類化合物的含量，紫杉醇的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，比較不同提取方法對云南紅豆杉的提取效果。以除雜現(xiàn)象、除膏率、除雜前后紫杉烷類化合物的損失情況為指標(biāo)，比較NaHCO₃萃取法、石油醚脫脂、石灰乳沉淀法的脫脂除雜效果，并考察除雜后藥液氯仿、乙酸乙酯萃取法，以及氯仿萃取物活性炭脫色的條件。分別考察了硅膠柱、大孔樹脂柱和氧化鋁柱的前處理工藝和柱層析條件。5.實驗經(jīng)預(yù)試篩選出敏感結(jié)腸癌細胞株SW480和HCT-8。藥物分為五組，每組5個濃度進行試驗。以MTT法研究紅豆杉提取物對于結(jié)腸癌細胞的增長抑制作用。對提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做了研究。并制定了藥材的含量測定限度。6.通過體外人工結(jié)腸液溶出實驗，篩選不同處方的腸溶固體分散體;制得的固體分散體使用包衣鍋法制備微丸，以圓整度、粒徑分布、堆密度、碎脆度為考察指標(biāo)，篩選稀釋劑的種類、稀釋劑用量和黏合劑的種類。7.采用體外人工胃液、腸液、結(jié)腸液溶出對微丸的體外溶出進行評價。對微丸的處方、制法、性狀、水分、含量測定等做了研究。結(jié)果：1文獻綜述利用各種檢索工具、數(shù)據(jù)庫，使用關(guān)鍵詞紅豆杉or紫杉醇、提取or分離、結(jié)腸腫瘤、靶向，共查閱文獻約90篇，國外多集中于紅豆杉的化學(xué)成分研究，國內(nèi)多集中于產(chǎn)地，含量測定，藥理藥效及臨床應(yīng)用研究。國內(nèi)可見有用指紋圖譜評定東北紅豆杉的質(zhì)量，見有對云南紅豆杉進行提取和鑒定以及抗腫瘤實驗的研究，見有體外紫杉醇免疫脂質(zhì)體對人大腸癌細胞的靶向作用的實驗，但未見有綜合以上技術(shù)對紅豆杉中主要抗癌組分開發(fā)利用并制出針對結(jié)腸癌的靶向制劑的研究報道。國外可見有為了提高紅豆杉中紫杉醇等有效成分的提取的研究，見有為提高紫杉醇治療的靶向性和提高效能的劑型研究報道。2活性組分的含量測定2.1含量測定樣品的制備：使用固相萃取柱進行分離，收取不同組段的流出液，測定紫杉烷類化合物，回收率較高。2有效組分含量測定：采用高效液相法建立準(zhǔn)確科學(xué)的測定云南紅豆杉藥材中三種紫杉烷類化合物的含量的方法，三者在0.04ug?3.0ug之間內(nèi)均呈線性關(guān)系。采用紫外分光光度法建立了準(zhǔn)確科學(xué)的測定總黃酮含量的方法，總黃酮線性范圍為8?48ug/ml。3藥材質(zhì)量研究3.1紅豆杉基源的研究經(jīng)過比較，云南紅豆杉的主要抗癌物質(zhì)紫杉烷類成分含量較高，較其他種的紅豆杉質(zhì)量要好，可以作為本實驗的原料藥材。3.2紅豆杉藥用部位的研究考察了云南紅豆杉的不同部位中紫杉烷類化合物的含量。雖然針葉中含量比樹皮中少，但采集針葉和嫩枝不會損傷植物，還可以不斷再生，且總量遠遠大于干皮，為保護資源，從云南紅豆杉枝葉中獲取紫杉烷類化合物具有重要的意義。3.3不同生長年限對云南紅豆杉枝葉質(zhì)量的影響隨著生長年限的增加，云南紅豆杉枝葉中紫杉類化合物的含量逐漸增加，因此枝葉的采摘以5年生以上為佳。4貯藏時間對云南紅豆杉枝葉質(zhì)量的影響隨著貯藏時間的加長，紅豆杉中紫杉烷類成分的含量有所降低，為保證紅豆杉的質(zhì)量，應(yīng)以新鮮的枝葉為佳，貯藏時間不易超過半年。4提取物制備工藝研究4.1提取工藝研究用不同溶劑及提取方法進行提取時，以乙醇浸漬法最優(yōu)，經(jīng)正交實驗篩選，最優(yōu)醇提條件為85%乙醇浸提兩次，第一次7倍量24小時，第二次5倍量12小時。超臨界CO₂萃取法先用純CO₂萃取，再加入夾帶劑進行萃取，優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑法對于紅豆杉中有效成分的提取。4.2初步除雜工藝研究NaHCO₃萃取法的乳化現(xiàn)象比較嚴重，且紫杉烷類化合物損失較大。石灰乳沉淀法能夠去除大量的雜質(zhì)，但是終點pH值很難控制，有效成分損失比較大；使用石油醚具有較好的脫脂效果。脫脂后的藥液以氯仿萃取四次就可將有效成分充分萃取干凈。氯仿萃取后的藥液用0.25%（W/V）活性炭，在35°C下脫色。4.3精制工藝采用硅膠柱一一大孔樹脂柱一一氧化鋁柱進行串聯(lián)分離精制紅豆杉中的有效組分。即浸膏氯仿溶解，加于已處理好的硅膠柱上，氯仿沖洗至流出液無色，用氯仿一甲醇（97：3）洗脫，收集3倍生藥量洗脫液減壓回收溶劑成浸膏，浸膏用適量乙酸乙酯一丙酮（1：1）溶解，濾除不溶物，濾液用適量大孔樹脂拌樣，加于處理好的大孔樹脂柱頂端，3倍柱體積30%乙醇洗脫，然后換用6倍柱體積85%乙醇洗脫。收集洗脫液減壓回收乙醇，適量氯仿溶解，濾除不溶物，加于處理好的氧化鋁柱頂端，氯仿洗至無色，換用7倍柱體積的氯仿一甲醇（97：3）洗脫，收集洗脫液，減壓回收氯仿，繼續(xù)減壓濃縮（60C，-0.08Mpa）至稠膏狀，將稠膏減壓干燥（60C，-0.08Mpa），得紅豆杉提取物。5紅豆杉提取物對結(jié)腸癌細胞的抑制作用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定在選定的范圍內(nèi)，紅豆杉提取物、紫杉醇、紫杉醇與三尖杉寧堿的混合物、紫杉醇與三尖杉寧堿與紅豆杉素W的混合物作用于結(jié)腸癌HCT-8和SW480細胞72h后，均表現(xiàn)出一定的細胞增長抑制作用。紫杉醇、紫杉醇與三尖杉寧堿的混合物、紫杉醇與三尖杉寧堿與紅豆杉素W的混合物的抑瘤作用逐漸增強。通過提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，規(guī)定按干燥品計算，提取物中含紫杉醇不得少于16%，含三尖杉寧堿和紅豆杉素W的總量不得少于35%。6固體分散體的制備方法以丙烯酸樹脂L100-55做為腸溶載體材料，取過60目的紅豆杉提取物一份用無水乙醇溶解，濾過，得1組，取丙烯酸樹脂L100-55樹脂二份，用無水乙醇溶解，得2組，在攪拌下將1組加入2組份中，混勻，回收乙醇，減壓干燥，研細，過80目篩，即得。微丸的制備：固體分散物一微晶纖維素一淀粉一滑石粉3：0.6：0.3：0.1混合均勻，以適量5%(w)PVP水溶液為黏合劑，制軟材，過20目篩制濕顆粒隨后投入包衣鍋。包衣鍋轉(zhuǎn)速設(shè)為90r/min，同時噴加少量粘合劑和混合粉，制得圓整性較好的微丸，40°C烘干后分樣過篩，收取14?30目微丸。7腸溶微丸的評價和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究從溶出曲線可以看出，微丸在胃液中2h沒有藥物釋放，在人工小腸液中3h時，紫杉烷類化合物溶出9?14%，在人工結(jié)腸液中9h基本上釋放完全。規(guī)定微丸按干燥品計，含紫杉醇不得少于4%，含三尖杉寧堿和紅豆杉素W得總量不得少于9%。結(jié)論：1.通過各種途徑查閱中外文獻資料及查新報告均未見有與本項目擬研究內(nèi)容相同的研究報道。2.所建立的活性組分含量測定方法準(zhǔn)確可行，重復(fù)性好，可用于紫杉醇、三尖杉寧堿、紅豆杉素W以及總黃酮的含量測定。3.通過對藥材的研究，規(guī)定使用的原料藥材為云南紅豆杉(TaxusyunnanensisChengetL.K.Fu）的枝葉部分，以5年生以上為佳，貯藏時間為半年以下。4.提取工藝，初步除雜工藝和精制工藝是課題的關(guān)鍵所在，優(yōu)選的工藝可以有效提取紅豆杉中的有效組分，通過接取含紫杉烷類化合物及總黃酮，總木脂素等的大類成分，改變了傳統(tǒng)的習(xí)慣的系統(tǒng)分離的收集方式，在一定程度上減少了有毒試劑的使用量，并大大縮短了過柱的周期，更加適合工藝化的大生產(chǎn)。大類成分的分離方法也更加符合中醫(yī)藥理論關(guān)于多成分多靶點的用藥特點，并且其中含有的其他有效組分可望在配伍后發(fā)揮協(xié)同治療的作用，并在一定程度上減輕毒副作用。5.體外結(jié)腸癌HCT-8和SW480細胞抑制試驗證明三尖杉寧堿與紅豆杉素W對紫杉醇抗腫瘤有一