代謝工程-周奕騰改+試卷

11級真題試卷代謝工程:利用基因工程技術,有目的地對細胞代謝途徑進展準確的修飾、改造或擴展、構建的代謝途徑,以轉變生物體原有代謝特性,并與基因調控、代謝調控及生化工程相結合,提高目的代謝產物活性或產量、或合成的代謝產物的工程技術科學。1,這兩種技術有助于代謝工程的分析方面蛋白質工程,合成生物學,有助于代謝工程的基因操作方面.三大代謝途徑：糖酵解EM、三羧酸循環(huán)TCA、磷酸戊糖途徑HM〕或稱PPP兩個應用實例：A、添加物導致代謝途徑酶活加強：加維生素增加了磷酸果糖激酶活性和乳酸脫氫酶活性，增加了乳酸的生產B、參加葡萄糖酸鈣能促進高6一磷酸葡萄糖脫氫酶和葡萄糖激酶的酶活力，促進了肌苷的合成4、酶調整方式、反響調整方式：5、5、轉錄的功能單位。以及調整基因的整個DNA子、組氨酸操縱子、色氨酸操縱子等6、分支代謝調整途徑：同功酶調節(jié)：催化一樣反響，但酶分子構造有差異；協(xié)同反響抑制：一個不能少；累積反響抑制：按比例累加，無協(xié)同效應，無拮抗作用；D.增效反響抑制：1+1>2(末端產物Y和ZE1產物過量并不影響其他末端產物的形成。只有當YZ同時過量，才能對E1制作用。)E.挨次反響抑制：按①→②→③挨次逐步抑制；F.聯(lián)合激活或抑制調整：途徑產物各自調整，同一中間產物；7、會計算累積反響抑制〔60%，20%，68%〕8、不同谷氨酸生產菌的兩大特征：α-酮戊二酸脫氫酶的缺乏;對生物素的需要(生物素缺陷型)9、代謝流(物流/通量)(flux)指流入代謝物經該途徑轉變?yōu)榱鞒鑫锏乃俾省?0、代謝流分析(metabolicfluxanalysis)：又稱代謝通量分析，一種計算流經各種途徑的通量的技術，用于描述不同途徑的相互作用和圍繞支點的物流分布。11、代謝設計原理：提高通向目標產物的代謝流；擴展代謝途徑；構建的代謝途徑12、代謝工程爭論的根本程序：改進靶點確實定；基因操作；效果分析13、基因操作：基因過量表達，基因敲除，異源基因導入14、四大組學：基因組學與比較基因組學；轉錄組學；蛋白質組學；代謝組學15、英文簡稱：LC：液相色譜；GC：氣相色譜；GC-MS：氣質聯(lián)用儀；NMR：核磁共振；HPLC:高效液相色譜；CE：毛細管電泳；2-DE：雙向凝膠電泳；DIMS：直接注射質譜；FT-IR：傅立葉轉換紅外色譜；IEF：等電聚焦；ESI—MS：電噴霧質譜；RI：示差折光檢測法；UV：紫外檢測法；了解基因的功能、表達調控機制和物種進化過程的學科。16、代謝工程的根本爭論思路環(huán)。17得到的結論，統(tǒng)稱為代謝通量分析18、代謝通量計算〔入為+，出為—〕18、AX(t)=0假設方程數(shù)小于反響速率數(shù)目〔代謝通量假設方程數(shù)大于反響速率數(shù)目，稱為超定系統(tǒng)。19的途徑。20、設計育種以及發(fā)酵工藝掌握的的五字策略：“進、通、節(jié)、堵、出”①進，促進細胞對碳源養(yǎng)分物質的吸?。虎谕?，使來自上游和各個注入分支的碳架物質能暢通地流向目的產物；產物；④堵，消退或減弱目的產物進一步代謝的途徑；⑤出，促進目的產物向胞外空間分泌。21的一些點〔代謝物。著終產物的得率，這些節(jié)點稱為主節(jié)點。著終產物的得率，這些節(jié)點稱為主節(jié)點。節(jié)點的安排比：節(jié)點輸出途徑的代謝流的比值。22、柔性節(jié)點：假設流入每一分支的流量簡潔轉變以滿足需求，這樣的節(jié)點稱為柔性節(jié)點(flexiblenode)。剛性節(jié)點：假設一個節(jié)點的一個或多個分支的安排率被嚴密掌握，則稱該節(jié)點是強剛性的。半柔性〔弱剛性〕節(jié)點：假設在一個節(jié)點的流量安排，由它的一個分支的動力學占優(yōu)勢，則稱該節(jié)點是半柔性〔弱剛性〕節(jié)點。23、會推斷〔柔性節(jié)點，安排比可變，總量一樣。剛性節(jié)點安排比不變，比例一樣〕112剛性：減弱B11PB2P12柔性：減弱B11PB2,P假設節(jié)點1或節(jié)點2為剛性時，B1增大，P1增大，P2減小。分3種狀況增加的＞削減的，P增加的＜削減的，P增加的≈削減的，P24、13CMFA原理與方法：利用同位素標記底物及NMR或GC-MS(氣相色譜-質譜儀)分冗余能更加準確地估算未知通量1)〔擬〕穩(wěn)態(tài)假設是MFA的重要前提。代謝穩(wěn)態(tài)和同位素平衡狀態(tài)標記底物的選擇必需慎重考慮。要合理設計標記底物組合方式以獲得最大通量信息。為降低試驗中底物用量方面的花費，生物反響器容積應盡量小。但反響器容積太小系統(tǒng)的穩(wěn)定條件便很難到達。因此目前使用的生物反響器容積通常在300-1000mL。25、作為運載體必需具備哪些條件？能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存。具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。具有某些標記基因，便于進展篩選。如抗菌素的抗性基因26、基因操作的根本步驟：1、目的基因的獵取；2、基因表達載體的構建；3、將目的基因導入受體細胞；4、目的基因的檢測與鑒定27、獵取目的基因的常用方法有哪些?〔1〕從基因文庫中獵取〔2〕PCR技術擴增〔3〕人工合成。。目的基因主要是指編碼蛋白質的構造基因28、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反響，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。②原理：DNA復制③條件：基因的核苷酸序列、四種脫氧核苷酸、一對引物(做啟動子)、DNA聚合酶.前提條件：2^n〔n為擴增循環(huán)的次數(shù)〕⑤結果：使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增。2PCR〔高溫〕〔低溫〕〔適溫〕延長30、同源重組〔英語：Homologousrecombination〕是遺傳重組的一種類型，指兩股具有相像序列的DNA的重排列，使遺傳物質發(fā)生交換?？砂l(fā)生于自然界中，或應用于人工的分子生物學技術。31、非同源重組又包括位點專一重組和格外規(guī)重組。32、生物轉化與組合生物轉化。論述題1、以大腸桿菌為宿主構建乙醇代謝工程生產菌和以釀酒酵母為宿主構建乙醇代謝工程生產菌各有什么優(yōu)缺點？大腸桿菌優(yōu)點：1〕底物譜寬，可以在廉價培育基上生長，含有木糖代謝基因，可以利用木糖〔2〕高密度培育，生長速率快；大腸桿菌的生理和遺傳背景清楚，有利于簡單遺傳操作。在好氧和無氧條件下均能產生乙醇?！病炒x副產物簡單，比方產生乙酸等副產物〔2〕對產物乙醇的耐受力量低，不利于積存高濃度乙醇。酵母優(yōu)點：厭氧生產乙醇時，代謝副產物少，對乙醇的耐受力量高，有利于積存高濃度乙醇。適合高密度培育。缺點：底物譜不夠寬，常用的釀酒酵母以糧食為原料，高產乙醇但是不能利用木糖，也就不困難：把其它菌的木糖異構酶基因導入到釀酒酵母，比方E.coliB.subtilis的木糖異構酶基因，但都沒有成功，有肯定難度。2、谷氨酸棒桿菌中色氨酸的生物合成途徑和代謝調整機制如圖3所示。試述色氨酸工程菌株的代謝設計策略。圖3 谷氨酸棒桿菌中色氨酸生物合成途徑及其代謝調整機制〔代謝途徑描述：谷氨酸棒桿菌中色氨酸的生物合成途徑和代謝調整機制如下圖。在谷氨酸棒桿菌EMP途徑和HMP途徑分別生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)4-磷酸赤蘚糖(EP)，兩者在DAHP合成酶(DS)3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。DAHP經三步酶促反響生成莽草酸，莽草酸經三步酶促反響生成分支酸。由(AS)催化下合成鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸在鄰氨基苯甲酸磷酸核糖移換酶(PRT)、色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸；另一方面，分支酸在分支酸變位酶(CM)的催化下生成預苯酸(PPA)。由(PD)酪氨酸；在預苯酸脫水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸，最終合成苯丙氨酸。在分支酸〕〔1〕加速限速反響PEP和EP的支路代謝，解除苯丙氨酸和酪氨酸對DS的反響調整，增加分支酸的濃度等方法。為了積存更多的PEP丙酮酸激酶活力低的菌株或者選育硫辛酸和硫胺素(分別為丙酮酸脫羧酶系和丙酮酸羧化酶系的輔酶)雙重缺陷突變株。將編碼限速酶的基因通過基因擴增，增加拷貝數(shù)拷貝數(shù)的載體上再導入宿主中去表達DS酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA等。trpE、trpD、trpC、trpB、trpA這五種構造基因集中在DNA將與色氨酸合成有關的基因克隆到質粒pDTS9901BPS-13,在500ml培育基中3035.2g/〔親株產20.1g/。爭論覺察，假設使大腸桿菌中色氨酸操縱子中的弱化子缺失，則trp基因表達量可提高六倍，而且無論是在阻遏細胞內還是在永久性突變的細胞內都是這樣〔即無論trpR或trpR會提高色氨酸的產量。轉變分支代謝途徑流向提高代謝分支點某一分支代謝途徑的酶活力酸和苯丙氨酸三條支路上的任何一條支路的酶活性被加強DS基因克隆到谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamiu中，構建精彩氨酸工程菌，它促使了Trp支路第一個產物氨茴酸AntTrp對該質粒所編碼的Ant合成酶和Ant磷酸核糖基轉移酶的反響抑制，結果色氨酸產量達43g/L。假設再將苯丙氨酸合成相關的酶基因如pheA基因敲除，則可使色氨酸產生菌產酸達50g/L。另外，切斷由分支酸到預苯酸、VK、CoQ的代謝支路，可節(jié)約碳源，使中間產物分支酸更多地DS而有利于色氨酸積存。具體可承受構建預苯酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、酪氨酸缺陷、VK缺陷、CoQ缺陷等代謝改造措施。據(jù)報道，有人以谷氨酸棒桿菌為動身菌株，經代謝改造得到的KY9456(Phe-+Tyr-)L-0.15g/L。這個產量是很低的，由此也可看出只構建缺陷型是不夠的，還必需解除由色氨酸引起的反響調整。AS酶缺陷的回復突變株，可增加色氨酸的積存。由于當