膠原蛋白的提取、結(jié)構(gòu)以及分子量測量

膠原蛋白的提取、結(jié)構(gòu)以及分子量測量膠原蛋白的提取、結(jié)構(gòu)以及分子量測量綜述一、前言膠原蛋白（collagen）是與各組織、器官機(jī)能有關(guān)的功能性蛋白，約占人體總蛋白的三分之一,存在于細(xì)胞外間質(zhì)，是具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族。膠原是人體重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分,在細(xì)胞生物學(xué)中有重要應(yīng)用價(jià)值。膠原是一個(gè)大的蛋白家族，至少有15個(gè)型別，各型膠原都具有一定的分子構(gòu)型和組織分布特點(diǎn)，其中以?型膠原分布最廣，膠原蛋白（或稱膠原）是按是否形成有周期性橫紋的膠原原纖維（collagenousfibril）可將其分為原纖維膠原蛋白（fibrillarorfibril-formingcollagen）和非原纖維收原蛋白（nonfibrillarornon,fibril,formingcollagen）兩大類。目前己發(fā)現(xiàn)的膠原蛋白類型己不下19種，原纖維膠原蛋白包括I、II、III、V、XI型膠原，在體內(nèi)以膠原纖維的形式存在。膠原纖維是骨骼、肌腱、骨間膜、皮膚、軟骨、韌帶等器官的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)，使這些器官具有很高的抗張強(qiáng)度。膠原纖維與組織器官的生物力學(xué)特性密切相夫原纖維膠原蛋白包括I、II、III、V、和XI型膠原，其余均屬于非原纖維膠原蛋白。非原纖維膠原蛋白具有膠原蛋白的基本特征，即三股螺旋結(jié)構(gòu)，但其結(jié)構(gòu)、分布和功能更具有多樣性、非原纖維膠原蛋白按其,,27超分了結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步分類。（l）結(jié)合于膠原原纖維表面的膠原蛋白（fibrilassociatedcollagenswithinterruptedtripleheliceFACIT）包括IXXIIXIVXVIXXI型膠原。（2）形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原蛋白包括IVVIIIX型膠原。（3）形成串珠狀纖維（beadedfilament）的膠原蛋白有VI型膠原。（4）形成固著原纖維（anchoringfibril）的膠原蛋白，有VII型膠原。（5）有跨膜區(qū)的膠原蛋白，有XIII和XVII型膠原。（6）結(jié)構(gòu)尚未明確的膠原蛋白包括XV和XVIII型膠原等。膠原不僅作為組織的支持物，而且對細(xì)胞、組織乃至器官行使正常功能及傷口愈合都有重大影響。膠原作為醫(yī)用生物材料比以往應(yīng)用的金屬、陶瓷或化學(xué)材料具有更大的優(yōu)越性，因此近20年來已被廣泛用于臨床（近年來，世界各國已將膠原制品廣泛應(yīng)用于臨床修復(fù)軟組織缺損，覆蓋燒傷創(chuàng)面、整形、牙周引導(dǎo)組織再生、口腔種植體、牙槽嵴再建及頜骨空腔修復(fù)。二、膠原蛋白的提取膠原多從牛皮、肌腱、鼠尾等部位提取，由于膠原是一個(gè)大的蛋白家族，是細(xì)胞外間質(zhì)的四大組分之一，幾乎分布于所有的組織中。到目前為止已發(fā)現(xiàn)脊椎動物的膠原類型達(dá)十多種之多，各型作用不一。膠原的異常改變涉及許多纖維化疾病，在腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移中，膠原的分布和類型也發(fā)生改受。因此在提取時(shí)常將各型分別提取。目前從組織提取膠原多采用分級鹽析的方法，在酸性條件下，I型和Ill型膠原沉淀的鹽濃度臨界點(diǎn)相近;在中性條件下，III型和IV型膠原沉淀的鹽濃度臨界點(diǎn)又很接近。因此提取時(shí)難度較大，程序復(fù)雜，需過柱純化，而且花費(fèi)時(shí)間長，易發(fā)生膠原變性。主要的提取方法分述如下:I型和II型膠原主要分布于細(xì)胞，組織之間及結(jié)締組織間質(zhì)中，屬于間質(zhì)膠原，在臟器纖維化病理過程中，I型和II型膠原起著重要作用。I型膠原是結(jié)締組織間質(zhì)中最主要的成分，一般制品多以I型膠原為材料（文獻(xiàn)上I型膠原的提取一般采用多次超速高心的辦法。李成章、樊明文從人胚骨中提取了I型膠原，用于膠原制品的制作。采用胚胎骨組織來提取膠原（一般認(rèn)為骨組織僅含有I型膠原，選用骨組織作為提取原料可省去分型、過柱純化等煩雜工序，簡便經(jīng)濟(jì)，易獲得純度較高的I型膠原（他們的方法為將脫鈣骨粉浸入0.5mol/LHAc24,48h,取上清緩慢加入研磨精細(xì)的NaCl（終濃度為4mol/L），攪拌過夜離1心35OOOXg,20min（下同），去上清，其沉淀物加入0.5mol/LHAc透析溶解，離心，取上清依次加入0.lmol/LTris,HCI（終濃度為0.01mol/L）,5mol/LNaOH（調(diào)pH至7.4），NaCl（終濃度為4mol/L），攪拌過夜，離心，去上清（沉淀以4mol/LNaCI（0.05mol,LTris,HCI洗一次，再加0.5mol/LHAC透析溶解，離心去沉淀，上清裝入透析袋內(nèi)，對NaCl溶府透析（平衡后NaCl濃度為10,）離心去上清，沉淀物用0.5mol,LHAC透析去鹽溶解，離心去沉淀，上清濃縮凍干以上所有液體及操作溫度均為4?。為提高抽提純度，骨粉應(yīng)越細(xì)越好，脫鈣必須完全（采用EDTA脫鈣，可使一些非膠原蛋白，如骨連接蛋白（osteonectin）隨之溶去，有利于提高膠原的純度（抽提的次數(shù)不應(yīng)太少，否則純度不夠，抽提次數(shù)太多則易發(fā)生膠原變性（他們所用抽提次數(shù)為3,4次，結(jié)果表明，所提膠原具有較高純度，可用于膠原制品的制作。首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院普外實(shí)驗(yàn)室的孫海晨、李鐸、劉爽、孫家邦對以往的I型膠原蛋白的提取作了一些改進(jìn)，只進(jìn)行了2次超速離心減少了步驟。一般文獻(xiàn)中在I型膠原的-1提取過程中要不斷使用不同濃度的NaCI,0.05mol?LTris-HCI緩沖液反復(fù)進(jìn)行離心、抽提。他們實(shí)驗(yàn)將其改為在3,醋酸的酸性條件下，直接加入40mL30,濃鹽水，不僅減少了步驟還節(jié)省了試劑和時(shí)間。他們的方法為:取鼠尾浸入75,酒精消毒30min移入PBS液中洗2次，去皮、抽取鼠尾腱，放入PBS液中洗2次，高速組織粉碎機(jī)粉碎后放入3,醋酸（每尾200mL），48h，1.2萬克離心2h。吸取上清加入30,濃鹽水40mL鹽析。離心4000g，30min。將沉淀溶入50mL0.1,醋酸內(nèi)，置透析袋內(nèi)與500mL1mol,L的HCI透析48h，其間換水5次。這樣可得到透明清亮的膠原溶液。加入0.15mL氯仿，敞開瓶口，用無菌紗布包住，置無菌工作臺48h使氯仿?lián)]發(fā)。取5mL溶液經(jīng)SEXTRYTM冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，定量膠原濃度為3.5g/L。王凱慧、李雅杰等從豬囊尾蚴中提取膠原蛋白，用紫外分光儀、SDS,PAGE、透射電鏡和ELISA等方法對豬囊尾蚴膠原蛋白作了初步分析。表明：(D豬囊尾拗中含有一定量的膠原蛋白；(2)膠原蛋白主要以I型為主，分子量在80kDa,130kDa之間；(3)通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，檢測其抗原性，證明其對人具有很強(qiáng)的免疫性。劉德莉、徐蓉等從雞趾肌腱中提取了I型和II型膠原。方法為:在9mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入ImL蛋白酶抑制劑(0.1mol/LTris,HCI、pH7.4、0.4mol/LNaCl、0.25mol/LEDTA、20mmol/LPMSF及10mmoL/LNEM)0.33mL乙酸溶液(0.5mol/L)及胃蛋白酶溶液(10g/L),混勻后，于4?溫和攪拌6h在4?離心(16000r/min)30min。留上清液，緩慢加入410mg氯化鈉粉末，邊攪拌邊混勻溶解，于4?冰箱鹽析過夜。第2天取出，高速低溫離心(l6000r/min)30min，取沉淀物，冷凍干燥2h，即為培養(yǎng)液中的膠原提取物。將組織標(biāo)本稱重后，以PBS洗凈，剪碎至lmm大小，置10mL0.5mol/L乙酸溶液膨脹過夜。4?勻漿(l0000r/min)5min，加入胃蛋白酶(酶量與濕組織之mg比為1:100)，于4,冷室攪拌消化6h,加TriS至pH7.4中止酶解，再4?離心(16000r/min)45min。取上清液，精確稱取氯化鈉(0.7mol/L，于10mL上情液中加入410mg氯化鈉)，在冰浴中，于上清液中邊緩慢攪拌邊加入氯化鈉至徹底溶解，置4?冰箱鹽析過夜，再4?離心(16000r,min)45min。取沉淀物，冷凍干燥2h，即為組織中的膠原。王新禾、張?jiān)露鸬纫韵拗菩晕傅鞍酌赶头植禁}析法從人胎盤中提取高純I、III型膠原分別免疫家兔，經(jīng)兔疫吸咐制備單一特異的抗人I、III型膠原抗血清。他們的方法為取胎盤去除臍帶和羊膜、搗碎、勻漿；限制性胃蛋白酶消化，4?20h(每20g濕重組織加入0.05%胃蛋白酶、0.5mol/L醋酸100ml);消化上清液（酸性）中加NaCl至l.Omol/L，沉淀為膠原混合物:隨后在中性條件下分別以1.5mol/L、2.5mol/LNaCl鹽析，反復(fù)數(shù)次分別得到I、III型膠原的初純品；用DE,52柱層析去除酸性大分予，得到純化的I、III型膠原。II型膠原是關(guān)節(jié)軟骨中主要細(xì)胞外間質(zhì)之一，多種風(fēng)濕性疾病的發(fā)生與II型膠原異常有關(guān)。現(xiàn)己知類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病與II型膠原自身免疫反應(yīng)有關(guān)，用II型膠原免疫某些動物2可誘導(dǎo)出多關(guān)節(jié)炎，然而口服II型膠原可通過誘導(dǎo)免疫耐受來治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。梅煥平、張?jiān)闯?、李華研究了II型膠原的微量提取和純化方法。

O.OQ1M醋赧透析2天”毎天更換透析液，蒸懈水透析1天O.OQ1M醋赧透析2天”毎天更換透析液，蒸懈水透析1天r$聚乙二陽6000儂耶克窣干燥3X.ttWllffi膠員平均簫2.5克艾節(jié)軟骨可疚11型膠原】0叫）兔關(guān)節(jié)透明軟骨洗Sifi.lOXTB#毎克軟骨加lOrnl4M鹽KM/Q.OSMTrtspEU.5.■TC下攪拌24小時(shí),12000牛3分鐘用工沉淀加均倍體積①訊酣酸胃蛋?白薦pH2,5“3（盒胃蠱廠I朝lOmp/lOOnjJ^海JS鈉20n^/IflOml）,攪It24小時(shí)同Y10000『5分鐘衛(wèi)工上清液（況淀部分重復(fù)傅蛋白稠酶解?抽捉」次）0.2M氯比鈉/D.OSM7為HO|⑷上透析透折內(nèi)液按誓克軟骨比I克已處理的DEAE纖維素比例混合1小時(shí)!200%30分神山乜上清液加氨基已酸*便其鍛度達(dá)0_1址工4氮化鈉粗析24小時(shí)上弋I50000^30分鐘?4貯上淸液加氮化衲使?jié)舛冗_(dá)44M愉器24小時(shí)*4覽l20（X^抽分邯,4*沉淀物用蒸譜水溶斛方法見上表。研究采用限制性胃蛋白酶降解法，去除部分伸直端尾肽，螺旋結(jié)構(gòu)不受影響，故仍保持II型膠原分了完整性，抗原性基本不受影響。微量提取法主要有如下技術(shù)改進(jìn)：(1)使用合適濃度的氨基己酸可有效地抑制膠原酶活性，減少膠原蛋白破壞，提高II型膠原收率；(2)在中性條件下只用2.4M氯化鈉鹽析去除I型膠原蛋白，再用4.0M氯化鈉沉淀II型膠原，沉淀物經(jīng)透析后使需干燥溶液體積減少80,，使低溫真空干燥容旯完成，又減少了II型膠原丟失。秦定一、單英等參照Byers等方法并略作改良分別從家兔和胎兒2種不同皮膚中提純2了III型前膠原肽。方法為:所有操作均在4?進(jìn)行，將皮膚切成約lmm大小碎片，置于pH7.4，150mmol,LTris,HCI20mmol/LEDTA、10mmol,LPHCH2S02F、10mmol/LPMB溶液中勻漿，在4?下提取48h。2000r,min離心lOmin，上清中加入。W(硫酸銨)=20%。離心15000r/min20min，用上述提取液重溶沉淀，加W(NaCl)=10,，30000r/min離心20min。用pH7.6，200mmol/LNaCl、50mmol/LTris-HCI溶液溶解沉淀即為III型膠原(CollagenTypeIII，CIII)和III型前膠原(ProcollagenTypeIII，PCIII)粗提物。將上粗提物充分透析后上DEAE-32纖維素柱層析，用pH7.5,2mol/L脲、20mmol/LNaCl、30mmol/LTris-HCI溶液平衡。洗脫，以去除酸性糖蛋白。為分離CIII與PCIII,再次經(jīng)DEAE-32纖維素柱層析，用pH7.0,2mol/L脲，0.02mol/LNaCl、0.05mol/LTris,HCI溶液平衡、洗脫，待穿過峰結(jié)束，用0.02,0.2mol/LNaCl梯度洗脫，分別收集CIII與PCIII。將PCIII溶于pH7.4，0.2mol/LNaCl、0.05mol/LTris-HCl、0.005mol/LCaC12、2.5mmol/LPMB溶液加入細(xì)菌膠原酶，37作用4h,置冰水終止酶反應(yīng)。酶消化產(chǎn)物在PH8.5,0.2mol/L碳酸氫胺溶液中透析平衡。再經(jīng)SephadexG,50凝膠過濾，分批加上酶消化產(chǎn)物進(jìn)行洗脫，收集第一峰，超濾濃縮，置pH8.6,2mol/L脲、0.05mol/LTris-HCl緩沖液中透析。過DEAE-52纖維素柱層析用0,0.35mmol/LNaCl梯度洗脫，收集主峰即為PIIIP。柴明勝、陳金國、葉仲賢、朱炳釵用人胎盤經(jīng)胃蛋白酶消化,氯化鈉分級鹽析沉淀后，進(jìn)一步經(jīng)過DEAE-52和CM-52柱層析純化提取IV型膠原。他們的方法為取人胎盤2只,剝離泡膜和結(jié)締組織后剪碎,分別用蒸餾水和含蛋白酶抑制劑0.05mol/L,pH7.2Tris-HCI緩沖液漂洗使胎盤組織由紅變白后制成勻漿。再用該緩沖液在4?洗提4h，離心后沉淀加入0（5mol,L醋酸溶解，邊攪拌邊加入胃蛋白酶，在6?提取24h。離心收集上清液，逐漸加入氯化鈉，使其濃度為1.2mol,L，然后攪拌過夜。沉淀用0.lmol,L醋酸溶解后，用0.05mol,LTris-HCI，PH7.4，0.2mol,L氯化鈉透析過夜（去除沉淀后逐漸加入氯化鈉使其濃度為2mol,L（所獲沉淀即為IV.C粗品。將粗品溶于0.05mol,LTris-HCI,PH8.6,2mol,L脲素，0.2mol/L氯化鈉緩沖液中，并用相同的緩沖液在4?透析24h后，用DEAE-52層析。收集穿過峰再用0.04mol,L醋酸鈉，PH4.8,2mol,L脲素透析后用CM-52柱層析，經(jīng)0,0.3mol,L氯化鈉梯度洗提，第一峰即為IV.C純品，透析除鹽、凍干于20保存。氨基酸分析表明甘氨酸含量占30,，羥脯氨醚占13,，兩個(gè)鏈的分予量分別在95000和70000，與Timpl報(bào)道相似，符合IV（C特征。姚敏捷、寇麗筠等人從胎盤中提取IV型膠原蛋白。方法為取正常分娩的胎盤，冰水沖去血液，置-20?冰箱冰凍2,3h后剪成小塊，制備勻漿。相繼用中性鹽提取液、0.5mol/LHAc分別抽提數(shù)次去除雜蛋白和血紅蛋白，至組織呈乳白色;胃蛋白酶消化，沉淀出I、III型膠原后的上清中含有IV型膠原;加NaCl至4.5mol/L，再以1000Xg離心lh棄上清，沉淀溶于0.lmol/LHAc中，再加NaCl至1.2mol/L，離心棄上清;沉淀加于0.5mol/LHAc，并進(jìn)行透析，1000Xg離心lh，上清含IV型膠原粗提物。將此粗提物在起始緩沖液（0.04mol/L醋酸鈉pH4.82mol/LUrea）中充分透析，加至平衡好的CM,52纖維素層析柱上，線性梯度洗脫（NaCl濃度從0.04,0.4mol/L），于230nm監(jiān)測至吸光值回到基線。收集的蛋白分別是IV型膠原。用0.001mol/L醋酸分別透析（＞48h）（以上操作均在4進(jìn)行）。冷涼干4燥后-50?冰箱保存。V型膠原（ColV）與其他型膠原一樣，由3條多肽鏈構(gòu)成，在分子構(gòu)成上有多種形式許祖德、張?jiān)露鸬炔捎酶牧嫉腘iyibizi方法從人的胎盤中提取a（V）、a（V）和a（V）123ColV的提取胎盤去臍帶、絨毛膜和羊膜;勻漿，胃蛋白酶消化4、20h（300mg酶,300g濕重置于0.5mol,L甲酸中）；加NaCl到6%，離心，沉淀置于緩沖液A中，加NaOI到2mol/L，離心，上清液加NaCI到4.5mol/L，離心，沉淀置于含0.7mol/LNaCI的0.lmol/L醋酸中，離心，上清液加NaCl到1.2mol/L離心，留沉淀（ColV粗制品）。ColV的純化ColV粗制品溶于0.5mol/L醋酸，加固體硫酸胺（144.7g/L），離心，上清液濃縮后，DEAE52柱層析（柱床3.5cmx12cm），用含0.02—0.34mol/LNaCI的緩沖液B梯度洗脫，留梯度洗脫第一峰前半部分（純ColV）。姚敏杰、王天成、寇麗筠等同時(shí)從人胎盤中提取出III、IV、V型膠原并進(jìn)行純化、氨基酸組分分析和SDS,PAGE分析。其方法為用正常分娩胎盤，冰中沖去血液置-202,3h后剪成小塊，在蒸餾水中浸泡，換水3,4次以迸一步去除組織中血液;沉淀組織制備勻漿，然后再相繼用pH為7.5、0.5mol/LTris-HCl1.0mol/LNaCl、0.5mol/L醋酸液抽提6d以去除雜蛋白和血紅蛋白，至組織呈乳白色為止；胃蛋白酶消化按20g濕重組織加入含有50mg胃蛋白酶的100ml0.5mol/L的醋酸中消化約4h，邊消化邊攪拌，1000r/min離心lh，在上清中加入研磨好的NaCl至0.7mol/L，邊加邊攪拌使III型膠原析出。根據(jù)III型膠原在中性條件下沉淀于

1.8mol/L的NaCl、II型膠原在酸性條件下沉淀于0.7mol/L的NaCI的特點(diǎn)經(jīng)多次反復(fù)進(jìn)行中酸性沉淀后獲得了III型膠原的粗制品。瞄裊 聖題圖氮墓碟労析1旳V型mtBt原魚廂lispro126nsAa-PSIuThr陽34鶴Ser173427Glu01K6[GO剛nsGlyJ33：H3Ah19Vtil2227S3Met號1flc17341申Leu11S3狐Tyr253W18291251?12HitfiIDSL/it?a715ArB6029畑舍計(jì)1財(cái)阿0為該衛(wèi)邕」口勵(lì)I(lǐng)即。千社站曲聽咎刖各種羸基酢敘5沉淀出III型膠原的上清中含有IV、V型膠原，將其對1.2mol/LNaCl、O.5mol/L醋酸透祈;沉淀溶于pH為7.4、l.Omol/LNaCl、0.05mol/L的Tris,HCl緩沖液中，離心棄沉淀；NaCl加至4.5mol/L1000r,min離心lh棄上清，沉淀溶于O.lmol/L醋酸中，NaCI加至1.2mol/L離心棄上清，沉淀于pH=7.4、O.lmol/LNaCl、0.05mol/L的Tris,HCI緩沖液中，并用同一緩沖液透析,1000r/min離心lh，上清含IV型膠原粗提物;沉淀則為V型膠原的粗提物。[16,17]合III、IV、V型膠原的純化III型膠原的粗提物在對pH為7.5、0.5mol/LTris,HCl、0.2mol/LNaCl,0.2mol/L尿素的起始緩沖液進(jìn)行充分透析后，加人已平衡好的DEAE,32纖維素層析柱上，用同一緩沖液洗脫，紫外(230nm)監(jiān)測至洗脫峰回到基線;收集的蛋白峰對0.001mol/L醋酸透析48h，冷凍干燥后-50?冰箱保存。IV、V型膠原在起始緩沖液pH為4.8的0.04mol/L醋酸鈉、2.0mol/L尿素中充分透析，加至平衡好的CM,52纖維索層析柱上，線性梯度洗脫(NaCl濃度從0,0.4mol/L)，230nm監(jiān)測至吸光值回到基線將收集的蛋白峰對0.001mol/L醋酸充分透析(,48h)，冷凍干燥后-50?冰箱保存。各型膠原的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果為III型膠原呈現(xiàn)出4條區(qū)帶;IV型膠原有4條區(qū)帶;V型膠原為3條區(qū)帶。各型膠原氨基酸分析結(jié)果:III型膠原的Hypro/Pro之比值為1:2;IV型膠原中以HyPrO、Hyl含量最多，Arg、Ala則較III型膠原為低，IV膠原的芳香族氨基酸含量較其它類型的膠原為高；v型膠原為細(xì)胞外膠原，它的氨基酸組成見附表;以上各型膠原的氨基酸分析結(jié)果與國內(nèi)外的報(bào)道相符超濾法用于膠原蛋白的分離超濾法就是應(yīng)用孔徑為10,20,,(或更大)的超濾膜來過濾含有大分子或微細(xì)粒子的溶液,使大分子或微細(xì)粒子從溶液中分離的過程。超濾的推動力是壓差,在溶液側(cè)加壓,使溶劑透過膜得到分離。超濾所用的膜為非對稱性膜,其表面活性層有孔徑10-9,2X10-8,的微孔，能夠截留相對分子質(zhì)量為500以上的大分子和膠體微粒，所用壓差為01,05,,,。超濾膜對大分子的截留機(jī)理主要是篩分作用,即符合所謂的毛細(xì)管流動模型。決定截留效果的主要是膜的表面活性層上孔的大小和形狀。除了篩分作用外,粒子在膜表面微孔內(nèi)的吸附和膜孔中的阻塞也使大分子被截留。由于理想的分離是“篩分”,因此要盡量避免吸附和阻塞的發(fā)生。超濾也存在濃差極化的問題,即在溶質(zhì)透過膜時(shí),溶質(zhì)在高壓側(cè)溶液與膜的界面上發(fā)生溶質(zhì)的聚集,使膜面上溶質(zhì)濃度高于主體溶液的濃度。超濾技術(shù)有不發(fā)生相變、能耗低、常溫下進(jìn)行等特點(diǎn),在食品工業(yè)中已得到廣泛的應(yīng)用,在蛋白質(zhì)濃縮與分離方面具有重要意義。超濾法分離大豆蛋白在國外已有報(bào)道,國內(nèi)研究也證明超濾技術(shù)用于蛋白分離具有切實(shí)[18]可行性。崔岸、朱峰等對超濾法生產(chǎn)大豆分離蛋白進(jìn)行研究，在小試規(guī)模基礎(chǔ)上，探討物料濃度、溫度、操作壓力、PH值、循環(huán)速度對超濾過程的影響。選取適宜大豆分離蛋白生產(chǎn)的超濾膜，超濾濃縮后，蛋白質(zhì)的截留率高于95,，蛋白質(zhì)的回收率達(dá)93(9,。以上的方法多用于生物領(lǐng)域的研究。提取過程多采用化學(xué)或者生物酶法并用鹽析法進(jìn)行提純，提取產(chǎn)物純度較高，但是工程比較復(fù)雜在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用較少，一般只用于科學(xué)研究。秘魯海洋漁業(yè)研究所已研究成功一種利用加工過程中的魚體廢棄物提取膠原蛋白的方法。這種方法是利用加工魚類后的廢棄物如魚皮、魚骨、魚鱗、魚刺等雜物，用堿性溶液處理將其軟化，然后再經(jīng)過提取濃縮、脫色脫臭的工序，最終生產(chǎn)出無色、無味的膠凝狀膠原蛋白。這種膠原蛋白可廣泛應(yīng)用于副食品、區(qū)藥、化妝品等工業(yè)中，一般每十噸魚廢棄物可提取三噸成品膠原蛋白。提取膠原蛋白后的廢渣仍可用作動物飼料。現(xiàn)在也有許多很多方法從皮革固體廢料中提取膠原蛋白。如氧化法、酸法、堿法、酸堿交替法、酶法等。酸的脫鉻能力很弱，且對膠原水解程度很大，明膠的產(chǎn)率低，膠原水解損失大，鉻也除不盡，只能得到低級皮膠與小分子多肽。堿法比酸法處理的效果好，膠原產(chǎn)物的產(chǎn)率和鉻6的脫除率都比較高在工業(yè)上已有應(yīng)用。當(dāng)酸處理與堿處理交替使用時(shí)，不僅脫鉻效率要比酸處理法的高，而且所得到的膠原產(chǎn)物的穩(wěn)定性和質(zhì)量都要比酸處理法的高。值得注意得是，酸堿交替處理時(shí)要注意酸堿使用的順序，一般認(rèn)為先使用堿處理為好。缺點(diǎn)是處理的過程中會產(chǎn)生有毒六價(jià)鉻且存放過久的鉻革屑中鉻脫不盡。酶的脫鉻能力強(qiáng)弱與酶的品種控制條件有很大關(guān)系。酶處理法對膠原的降解程度較大，得到的產(chǎn)物分子小產(chǎn)率較低，鉻的脫除率較低。單純用酶處理含鉻的革屑效果并不好?，F(xiàn)在研究的熱點(diǎn)是二步處理法，即先脫鉻而后用酶水解。美國東部農(nóng)業(yè)所MM.Taylor、EMBrown等用堿酶處理法提取用于化妝品、粘合劑、打印和照相工業(yè)等用的凝膠性蛋白產(chǎn)物，首先在溫和的堿性條件下生成高分子量的凝膠性蛋白，然后用酶處理剩下的沉淀回收鉻與小肽明膠和膠原蛋白產(chǎn)物的收率較高，但酶只能使用一次成本較高。用堿一一酶處理也有一些不足之處：）酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、pH值和無機(jī)離子等外界因素的影響錫，容易變性失活。12） 一般都是在水溶液中與底物反應(yīng)，這樣就使酶在反應(yīng)系統(tǒng)中與底物和產(chǎn)物混和一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有較高的活力，也難于回收利用，不僅增加生產(chǎn)成本，也不利于連續(xù)化生產(chǎn)。3） 反應(yīng)后，酶與產(chǎn)物混在一起，成為雜質(zhì)，給進(jìn)一步的分離純化帶來困難。解決這些問題的方法之一就是酶固定化技術(shù)的應(yīng)用。將酶與水不溶性載體結(jié)合制成固定化酶，固定化酶可在一定空間進(jìn)行催化反應(yīng)又克服了游離酶的不足之處，可反復(fù)連續(xù)使用，易與產(chǎn)物分離。目前國內(nèi)研究蛋白酶固定化技術(shù)的人很多，黃雅欽、冷延國、黃明智用殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑制成固定化ASI.398中性蛋白酶制備水解明膠，固定化酶在使用12次后其活性仍為降低，所得水解產(chǎn)物分子量分步也較窄，證明固定化酶用于提取膠原蛋白也是可行的，但目前還未見有人把固定化酶用于皮革廢棄物的處理。

J/lJIIIi■Hf&和朋%i'F學(xué)饗眠巧尸弔1=sn■VSfiSFHH11r*■ihP￡■ril1.麼怎戰(zhàn)F、卞ii1J'■1i? 1i1171?卄XV懶州卜1站1i肓HAffinlvIIIT1M1'■i?"Hi?■IIJi建上IR*L.Ah11IHII51II14II：?II1?AM畑弓MJI4K4Ml"嵌z1■tilI■ih￥lI1.WPKHKK7.ITKl藥遞駅、lI-?18ThII?r.■1-.眾站：IlKII幼1ii吒尹WL.Flr211?■八圧抽號IBHYFRI1ii'富M-fK!匸恫山liiii入乂嬰酶斫屯丄呵*賀奧用三、膠原蛋白的結(jié)構(gòu)膠原蛋白分子是一個(gè)長3000A直徑為15A的桿狀物，是已知的最長蛋白質(zhì)之一。膠原8蛋白分子量是由3條大小相似的多肽鏈組成，3條多肽鏈都有螺旋構(gòu)象。3條螺旋互相纏繞，形成一個(gè)超螺旋在這個(gè)超螺旋中，每個(gè)殘基上升2.9A，每一圓周有3.3個(gè)殘某。這三股多肽[19]互相以氫鍵形式結(jié)合起來。關(guān)靜等用SDS,PAGE法對膠原海綿進(jìn)行了較全面的結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明酶解法制備的膠原海綿除含有a、B、丫組份以外，還含有分子量高于Y及分子量低于a的組份;其中Y組份是a組份的三聚體，B組份是a組份的二聚體，符合膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征;膠原海綿的Y組份及分子量高于Y的組份含量約是明膠標(biāo)準(zhǔn)品的兩倍;分子量低于a的組份含量較少，與膠原蛋白的組成特征相符。膠原蛋白具有四級結(jié)構(gòu):氨基酸組成、肽鏈形成的三股螺旋結(jié)構(gòu)、由原膠原分子形成的膠原纖維結(jié)構(gòu)以及膠原纖維的編織結(jié)構(gòu)。如下圖陽十00丄甘一膠原蛋白具有四級結(jié)構(gòu):氨基酸組成、肽鏈形成的三股螺旋結(jié)構(gòu)、由原膠原分子形成的膠原纖維結(jié)構(gòu)以及膠原纖維的編織結(jié)構(gòu)。如下圖陽十00丄甘一? 一護(hù)-)1-麗前”甘、丁1kA—104A單個(gè)的I型膠原分子量約285kD,寬14埃，長約3000埃。有三條多肽鏈組成。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)，由纖維細(xì)胞、神經(jīng)上皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等合成，并分泌到細(xì)胞外的生物大分子，為纖維性蛋白多聚體，由它的前體膠原分子按照一定的形式排列聚合而成。原膠原分子是由3股a肽鏈鏈組成的超螺旋體，哺乳動物個(gè)體中有30種不同的多肽鏈構(gòu)成約16種不同的膠原。[20,21]膠原的氨基酸組成有其特點(diǎn)，甘氨酸約占氨基酸總量的1/3，羥脯氨酸約占氨基酸總量的10,(羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白，而不存在于一般蛋白質(zhì)中(各型膠原的氨基酸組成也各有特點(diǎn)，如I型膠原中羥脯氨酸與脯氨酸之比約為0(7,0.8(膠原蛋白的氨基酸組成有如下特征:1)甘氨酸幾乎占總氨基酸殘基的三分之一，即每9隔兩個(gè)其他氨基酸殘基(X,Y)即有一個(gè)甘氨酸，故其肽鏈可用(甘-X-Y)n來表示。2)含有較多在其他蛋白質(zhì)中少見的羥脯氨酸和羥賴氨酸殘基，也有較多脯氨酸(pro)和賴氨酸。如脯氨酸(pro)和4-羥脯氨酸(4-hydroxyproline,Hyp)含量高達(dá)15-30%。同時(shí)還含有少量3-羥脯氨酸(3-hydroxyproline)和5-羥賴氨酸(5-hydroxylysine,hyl)。羥脯氨酸殘基可通過形成分子內(nèi)氫鍵穩(wěn)定教員蛋白分子。例如，正常膠原在39變性，而在缺乏脯氨酸的羥化酶條件下合成的膠原在24變性成為白明膠(gelatin)。而羥賴氨酸上可結(jié)合半乳糖-葡萄糖苷，與特定組織功能相關(guān)。如在基底膜膠原(IV型)中含hyl較多，含糖也較多，可能與基底膜的慮過功能有關(guān)。3)膠原中缺乏色氨酸，所以它在營養(yǎng)上為不完全蛋白質(zhì)。在膠原纖維中，膠原蛋白分子單位稱為原膠原(tropocollagen)。每個(gè)原膠原分子由三條a-肽鏈組成，a-肽鏈自身為a螺旋結(jié)構(gòu)，三條a-肽鏈則以平行、右手螺旋形式繞成“草繩狀”三股螺旋結(jié)構(gòu)見圖。肽鏈中每三個(gè)氨基酸殘基中就有一個(gè)要經(jīng)過此三股螺旋中央?yún)^(qū)，而在此處空間十分狹窄，只有甘氨酸適合此位置，由此可以解釋其氨基酸組成中每隔兩個(gè)氨基酸殘基出現(xiàn)一個(gè)甘氨酸的特點(diǎn)。而且三條a-肽鏈?zhǔn)墙诲e(cuò)排列的，因而使三條a-肽鏈中的Gly、x、y殘基位于同一水平上，借Gly中的N-H基與相鄰鏈X殘基上羥基形成牢固的氫鍵見下圖，以穩(wěn)定其分子結(jié)構(gòu)。原纖維膠原蛋白原纖維膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)己為X,線衍射圖像所證實(shí)，是三條a鏈相互纏繞形成的右手超螺旋結(jié)構(gòu)。螺距9.6nm，每圈每股含36個(gè)氨基酸殘基即12個(gè)Gly,X,Y三聯(lián)體。三股螺旋中，沿a鏈每第三個(gè)氨基酸殘基位于螺旋中心，其空間大小僅能容納分子量最小的氨基酸即甘氨酸。形成三股螺旋結(jié)構(gòu)還需:？有足夠的羥脯氨酸；？C，前肽鏈間二硫鍵的形成。每條a鏈至少要有100個(gè)Y位羥脯氨酸殘基才能形成穩(wěn)定的三股螺旋。脯氨酸和羥脯氨酸的五環(huán)結(jié)構(gòu)使膠原蛋白具有剛性。加強(qiáng)三股螺旋穩(wěn)定性的還有分子內(nèi)交聯(lián)等化學(xué)鍵。a鏈的端肽形成膠原蛋白的球狀結(jié)構(gòu)區(qū)。下圖膠原的右手超螺旋結(jié)構(gòu)為膠原的右手超螺旋結(jié)構(gòu)原纖維膠原蛋白分子直徑15nm，長度300nm，分子量約為300kDa。II、III型膠原蛋白由三條相同的a鏈構(gòu)成，為同三聚體(homotrimer),其余為異三聚體(heterotrimer)，a鏈的組成方式分別為；，a1(I),2a2(I)、a1(V)a2(V)a3(V)、a1(XI)a2(XI)a3(XI)。[a1(I)]3、，a1(V),3、，a1(V),2a2(V)也少量地存在于細(xì)胞培養(yǎng)液和胚胎組織。a鏈Gly,X,Y重復(fù)序列的連續(xù)性是原纖維膠原蛋白區(qū)別于非原纖維膠原蛋白的重要10特怔，也是形成高度有序的膠原原纖維的基礎(chǔ)。Gly代表甘氨酸，X常為脯氨酸，Y常為羥脯氨酸或羥賴氨酸。因此，原纖維膠原蛋白的氨基酸中，甘氨酸約占1,3，脯氨酸和羥脯氨酸占1,5以上，還有大量的羥賴氨酸和丙氨酸。除III型膠原外，Gly,X,Y序列中均不含半胱氨酸。原纖維膠原蛋白的a鏈約有330個(gè)Gly,X,Y重復(fù)序列。a鏈的極性氨基酸和非極性氨基酸相間排列成極性區(qū)和非極性區(qū)，總之，原纖維膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)十分規(guī)則。編碼a鏈螺旋區(qū)的DNA高度保守，外顯子的堿基對數(shù)目都是54的整倍數(shù)或是這種外顯子的重組，生物進(jìn)化過程中，從海膽起，編碼膠原的基因就非常相似，提示各型原纖維膠原蛋白有共同的基因起源。a鏈呈左手螺旋，每圈有33個(gè)氨基酸殘基，螺距為0.87nm。各型原纖維膠原蛋白的a鏈基本相似，a(V)、a(V)、a(XI)、a(XI)之間具有高度1312的同源性，a(XI)和a(lI)是同一基因的產(chǎn)物，a(XI)的糖化程度更高。編碼a(II)1313的外顯子有兩種拼接方式，分別合成IIA和IIB膠原蛋白°a(IIA)的氨基端比a(lIB)11多69個(gè)氨基酸殘基，分布于軟骨膜、椎間盤髓核等非軟骨組織。膠原原纖維原纖維膠原蛋白首尾相接，平行排列，聚合成膠原原纖維。由于a鏈的氨基酸交替出現(xiàn)極性區(qū)和非極性區(qū)，以頭尾極性較大，相互平行的膠原蛋白縱向錯(cuò)開1/4分子長度(約70nm)，以相鄰分子的極性區(qū)和非極性區(qū)的靜電引力彼此聚合，首尾相接的膠原蛋白又保持一定距高，這樣形成了膠原原纖維的疏區(qū)和密區(qū)，用醋酸鈾或磷鎢酸染色時(shí)，重金屬沉積于疏區(qū)，透射電鏡觀察可見膠原原纖維呈現(xiàn)64,70nm的周期性橫紋。由于極性區(qū)和非極性區(qū)的規(guī)律性分布，每周期內(nèi)又出現(xiàn)幾條明暗相同的橫紋。原纖維膠原蛋白再以分子間交聯(lián)形成穩(wěn)定的膠原原纖維，交聯(lián)形式以醛胺縮合為主。膠原原纖維是原纖維膠原蛋白自我裝配形成的超分子結(jié)構(gòu)。原纖維膠原蛋白聚合的程度及快慢，亦即膠原原纖維的粗細(xì)因膠原類型而異，也因組織器官、年齡等不同而異，差別很大，直徑在20,200nm之間。最細(xì)的只有幾個(gè)nm，由5個(gè)原纖維膠原蛋白分子構(gòu)成。原纖維膠原蛋白的聚合受C-前膠原，N,前膠原等中間產(chǎn)物的調(diào)控。C,前膠原和N,前膠原即切去了N,前肽或C,前肽的前膠原。原膠原分子平行排列成束，通過共價(jià)交聯(lián)，可形成穩(wěn)定的膠原微纖維(microfibril),進(jìn)一步聚集成束，形成膠原纖維。膠原分子內(nèi)通過分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)成為不溶性的纖維。因膠原分子氨基酸形成中缺乏半胱氨酸，不可能像角蛋白那樣以二硫鍵相連，而是通過組氨酸與賴氨酸間的共價(jià)交聯(lián)，一般發(fā)生在膠原分子的C-或者N-末端之間。膠原樣多聚體三螺旋軸的c端投影圖膠原纖維在不同組織中的排列方式與其功能相關(guān)。如在肌腱、皮膚及軟骨，要分別在一維、二維和三維方向承受張力，因而其膠原纖維排列分別為平行束狀，多角的纖維片層及不規(guī)則排列等方式。若干膠原原纖維借蛋白多糖、糖蛋白等粘合質(zhì)聯(lián)結(jié)成小束，繼而由小束集合成直徑l,2um的膠原纖維。膠原原纖維也可以直接聚合成膠原纖維。由于膠原蛋白和a-鏈的螺旋方向剛好相反，膠原蛋白又是首尾相接，平行聚合，膠原纖維在偏振光顯微鏡下呈雙折射現(xiàn)象(birefringence)。各型膠原蛋白形成的膠原纖維粗細(xì)不等，在偏振光顯微鏡下還顯示不同的顏色，由此可對膠原蛋白的類型作粗略的估計(jì)，如I型膠原纖維呈黃色或紅色,111型膠原纖維呈綠色。I、III、V型膠原分布廣泛而且往往共存于同一組織，III型膠原在彈性較大的組織如血管和皮膚分布較多，而肌鍵和骨則以I型膠原為主°II型和XI型膠原特異性地分布于軟骨和玻璃體。IV型膠原(COLIV)是基膜的主要成分?；げ坏删S持組織構(gòu)型，而且可調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用。目前發(fā)現(xiàn)許多疾病與基膜的結(jié)構(gòu)和代謝缺陷相關(guān)，COLIV屬三股螺旋蛋白家族，含大量的羥脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸，幾乎不含芳香簇氨基酸，所以其抗原性較弱。其中許多涉及COLIV，如腎臟病，肝、肺纖維化及糖尿病等。尤其是纖維化疾病，COLIV的含量與結(jié)締組織的增生程度呈正相關(guān)。IV.C是基底膜的主要組成部分(與體內(nèi)其它纖維性膠原不同，它至少由二個(gè)不同的鏈組成，即a(IV)和a(IV)。21其主三螺旋約330nm長，氨基端三螺旋約30nm長，而羧基端為球狀的非膠原結(jié)構(gòu)區(qū)(分于呈絲狀，頭、尾分別相連形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)其中四個(gè)氨基末端以二硫鍵相連構(gòu)成四聚體(PIVNP)稱為7S,而二個(gè)羧基末端的球體互相吸引形成二聚體(PIVCP)稱為NCI。根據(jù)原膠原分子a肽鏈的構(gòu)成、氨基酸組成和立體結(jié)構(gòu)的不同，可將膠原分子分為約15種類型［25］。在超微結(jié)構(gòu)上I,III型膠原有周期性橫紋，橫紋間距在52,62nm，而其它型膠原則為細(xì)絲狀，無明顯周期性橫紋。在電鏡觀察中，常在一些病變組織中和某些腫瘤間質(zhì)中及瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見到一種明暗橫紋間隔大于62nm的膠原纖維，由于其橫紋間隔大于正常膠原的橫紋間隔（52,62nm）,因此稱它為長間距膠原（LSC）。有關(guān)LSC的超微結(jié)構(gòu)特征國外己有報(bào)道，1960年Luse在雪旺細(xì)胞瘤間質(zhì)電見到一種間距在100nm,150nm且聚集成梭形的膠原小體。稱為Luse小體。Dingemans把長間距膠原分為兩種類型，致密型和疏散型。致密型含蛋白多糖，疏散型則不含蛋白多糖。但他們僅報(bào)道2型，樂美兆等經(jīng)電鏡觀察和免疫組化染色，對17例惡性腫瘤，11例良性雪旺細(xì)胞瘤和2例椎間盤脫出癥的髓核進(jìn)行研究，根據(jù)它們的超微結(jié)構(gòu)特征，將LSC分為3型，即小體型、疏散型和單股型。小體型和疏散型可見于神經(jīng)鞘瘤的間質(zhì)中，也可見于腹壁侵襲性纖維瘤病，惡性橫紋肌樣瘤和滑膜肉瘤的間質(zhì)中和瘤細(xì)胞胞質(zhì)中，而單股型僅見于1例椎間盤脫出的髓核中。小體型LSC是由長間距膠原纖維聚集而成的梭形小體，纖維排列致密，周期性明暗橫紋間隔在90,160nm，暗帶明顯，排列有序，平直。小體周緣界清，此型LSC可見于神經(jīng)鞘瘤的間質(zhì)中，也見于腹壁侵襲性纖維瘤病，惡性橫紋肌樣瘤和滑膜肉瘤的間質(zhì)中和瘤細(xì)胞胞質(zhì)中（圖l,3）。疏散型LSC不形成特定的梭形小體，膠原細(xì)絲排列疏松，暗帶電子密度低，常呈波浪狀，不規(guī)則，橫紋間隔距離與小體型基本相同，周界不清，此型可與小體型LSC同時(shí)存在于間質(zhì)中和瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，也可單獨(dú)存在（圖4）。23單股型LSC不同于上述兩型，既不形成梭形小體，也不匯集在一起，而是呈單股狀隨意分布于無定形的或纖維性基質(zhì)中，它的形態(tài)類似于I,III型膠原纖維，但它的周期性間隔超過I,III型膠原，它的平均間距為70,100nm.（圖5）。目前僅見于椎間盤脫出癥的髓核中，并不存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。有關(guān)長間距膠原的性質(zhì)主要有兩種觀點(diǎn)：(1)大部分LSC為VI型膠原(2)LSC是膠原纖維裂解時(shí)的中間階段。Dingemens等為明確長間距膠原的性質(zhì)，應(yīng)用抗1,111型膠原抗12體，經(jīng)免疫電鏡標(biāo)記，未發(fā)現(xiàn)這些抗體與LSC反應(yīng)。因此，他認(rèn)為LSC是膠原纖維裂解時(shí)的中間階段。我們對瘤細(xì)胞內(nèi)見到小體型和疏散型LSC的1例橫紋肌樣瘤和1例侵襲性纖維瘤病進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)這些瘤細(xì)胞Vimentin陽性，Myoglobin陰性，說明這些瘤[26]細(xì)胞并非肌源性，而可能是間葉性。結(jié)合于膠原原纖維表面的膠原蛋白.(FACIT)FACIT子結(jié)構(gòu)可分為三個(gè)區(qū):一區(qū)與膠原原纖維結(jié)合;二區(qū)剛性較好，是支撐一區(qū)的功能臂;三區(qū)借二區(qū)伸出膠原原纖維與細(xì)胞或細(xì)胞外間質(zhì)的其他成分結(jié)合。其中一區(qū)，特別是COL1的氨基酸序列相對比較保守，在NO1與COL1交接處都有Cys,(Xaa)4,Cys序列(Cys代表半胱氨酸)，形成鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵。三區(qū)變異最大，與各型膠原的特殊功能有關(guān)。FACIT膠原的另一特點(diǎn)是。鏈兩端的非膠原區(qū)在細(xì)胞外不被蛋白酶水解、FACIT不形成膠原原纖維，而是位于其表面，作為膠原原纖維與其他結(jié)構(gòu)相互作用的中介，IX型膠原和XII、XIV型膠原分別與II型和I型膠原形成的膠原原纖維結(jié)合，XVI、XIX型膠原的倩況尚不明確，其中IX型膠原發(fā)現(xiàn)較早，研究較多。IX型膠原NC4)和膠原區(qū)IX型膠原有三條不同的a鏈，屬異三聚體、a鏈的非膠原區(qū)(NC1,(C0L1,C0L3)依次沿羧基端向氨基端方向交替排列。由于存在可變啟動子(alternativepromoter)，軟骨的a(IX)NC4有243個(gè)氨基酸殘基，呈堿性，可與富含陰離了的糖胺1而在角膜初級基質(zhì)和玻璃體只有2個(gè)氨基酸殘基、此外，a(IX)NC3比a(IX)多糖結(jié)合,21NC3多出5個(gè)氨基酸殘基，序列為纈氨酸，谷氨酸,甘氨酸，絡(luò)氨酸,丙氨酸，能與硫酸軟骨素或硫酸皮膚素結(jié)合。因此，IX型膠原也是一種蛋白多糖，其側(cè)鏈在軟骨內(nèi)較短，在鳥類的玻璃體則很長。IX型膠原的三條a鏈均以COL2的氨基端與a(II)的N,端肽形成共價(jià)交聯(lián)，交聯(lián)形式為吡啶或羥基吡啶(hydroxypyridinium)，a(IX)C0L2還與a(II)C,端肽結(jié)合。31COL3和NC4伸出膠原原纖維，與細(xì)胞外間質(zhì)中的糖胺多糖結(jié)合，使細(xì)胞外間質(zhì)具有整體性和穩(wěn)定性，使軟骨能較好地承受外部擠壓和內(nèi)部膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力。XII和XIV型膠原XII型膠原為同三聚體，有XIIA和XIIB兩亞型。a鏈包括COL1,COL2和NC1,NC3，NC3很長。XII型膠原蛋白的分子構(gòu)型包括三部分：中NC1,COL2形成長75nm卷曲的尾，由NC3形成的球形中心及三個(gè)末端有小型球狀結(jié)構(gòu)，長度為80nm(XIIA)或60nm(XIIB)的指狀結(jié)構(gòu)°a(XII)COLl與a(XII)與a(IX)COL1氨基酸殘基數(shù)目相111近，氨基酸和核苷酸序列都有50,相同，羧基末端都有一個(gè)半胱氨酸殘基，兩個(gè)非Gly,X,Y序列的位置相似，二者具有部分同源性°a(XII)NC3中的213個(gè)氨基酸殘基也有134,相同，都有4個(gè)半胱氨酸殘基處于相似的位置，因此也有一定的同源性。XIV型膠原的結(jié)構(gòu)與XIIA型膠原極為相似。兩種膠原的分布有組織特異性，在皮膚，XII型膠原以XIIB為主，分布于網(wǎng)狀層和血管周圍;XIV型膠原分布于乳頭層、軟骨內(nèi)，XII型膠原以XIIA為主，局限分布于關(guān)節(jié)面、軟骨管周圍、關(guān)節(jié)面、軟骨膜及軟骨膜下層；XIV型膠原的分布則較為廣泛。兩種膠原的分布在胚胎發(fā)育時(shí)期都存在動態(tài)變化。與IX型膠原不同，XII型和XIV型膠原與膠原纖雉的結(jié)合缺乏共價(jià)交聯(lián)，主要由氫鍵和二硫鍵完成、軟骨內(nèi)的XIIA型和XIV型膠原還結(jié)合有硫酸軟骨素，結(jié)合部位在XII型膠原為NC3,,,14在XIV型膠原可能是NC1或NC2。XIV和XIX型膠原XIV和XIX型膠原發(fā)現(xiàn)較晚，和原纖維膠原蛋白的關(guān)系還不清楚，結(jié)構(gòu)上與IX、13XII、X、IV型膠原都有不同程度的相似性。NC1和COL1的鄰接區(qū)含有Cys,(Xaa)4,Cys序列而歸入FACIT類、a(XIV)有10個(gè)膠原區(qū)，a(XIX)有5個(gè)膠原區(qū)°a(XIX)111NC11和a(XIX)NC6較長，成為膠原纖維與細(xì)胞外間質(zhì)其他成分相互作用的橋梁。1IV、VIII和X型膠原IV型膠原是基膜所特有的結(jié)構(gòu)蛋白，VIII型膠原僅存在于分隔角膜內(nèi)皮和基質(zhì)的角膜后界層即Descemen's膜，X型膠原特異性地由軟骨內(nèi)成骨時(shí)期的肥大性軟骨細(xì)胞(hypertrophicchondrocyte)合成，分子結(jié)構(gòu)與VIII型膠原極其相似，因此劃為一類。(1)IV型膠原迄今己發(fā)現(xiàn)IV型膠原有6種a鏈，，a(IV),a(IV)是主要的結(jié)構(gòu)形式。a122鏈由NC1、C0L1、NC2三部分組成，COL1很長，有1400多個(gè)氨基酸殘基，包括20余個(gè)含2,24個(gè)氨基酸殘基的非Gly,X,Y序列°IV型膠原蛋白全長400nm，NC2和部分COL1組成長度為30nm的7S區(qū)，含有半胱氨酸和賴氨酸，NC1也富含半胱氨酸。通過二硫鍵和共價(jià)交聯(lián)作用，膠原蛋白單體經(jīng)NC1聚合成為二聚體，再經(jīng)7S聚合形成四聚體，四聚體最后形成立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，容納層粘連蛋白，巢蛋白復(fù)合物(laminin,nidogencomplex)和硫酸肝素蛋白多糖等基膜成分，使基膜具有機(jī)械和化學(xué)的屏障功能。IV型膠原廣泛分布于細(xì)胞外間質(zhì)，是由三條a鏈構(gòu)成的異三聚體、a鏈中NCI,COL1,NC2組成。COL1很短，含2個(gè)非Gly,X,Y序列。NC1和NC2較長，以a(IV)NC23最長，有18O4個(gè)氨基酸殘基°IV型膠原單體反向聚合成為二聚體，單體間重疊75nm為內(nèi)區(qū)(innerregion)，有NC1形成的大型球狀結(jié)構(gòu)，兩側(cè)30nm為外區(qū)(outerregion)，包括部分COL1和NC2形成的小型球狀結(jié)構(gòu)。兩個(gè)二聚體再度平行聚合形成四聚體。最后，四聚體首尾相接外區(qū)之間部分重疊，形成周期為100nm的微原纖維(microfibril)，內(nèi)區(qū)的大型球狀結(jié)構(gòu)使微原纖維呈串珠狀、微原纖維進(jìn)一步聚合形成膠原纖維。IV型膠原結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為:？COL1有識別整合素的RGD序列。？COL1形成N,糖苷鍵必需的天冬酰胺,X,絲氨酸，蘇氨酸序列。？NC1、NC2含有vonWillebrand因子(vWF)A型序列。？a(VI)NC13含有與纖連蛋白和腱生蛋白(tenascin)、Kunitz型蛋白酶抑制劑、涎蛋白相似的氨基酸序列。？能結(jié)合核心蛋白聚糖(decorin)和hyaluronan。(2)VIII和X型膠原本組膠原蛋白的a鏈最短，分子量只有60kDa左右，包括NC1、COL1和NC2。X型膠原為同三聚體，VIII型膠原的分了結(jié)構(gòu)可能是[a(VIII)]a(VIII)。三條a鏈，尤其是122NC1和COL1的基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列都極其相似。兩種膠原蛋白單體梭基端(NC1)聚合成多聚體，多聚體在氨基端(COL1，NC2)結(jié)合，形成六角形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。VIII型膠原分布于角膜后界層，X型膠原與鈣的親和力較高，短期地存在于軟骨內(nèi)成骨過程的肥大區(qū)(hypertrophiczone)，隨骨化而消失，說明它參與了軟骨的鈣化作用。VII型膠原首先發(fā)現(xiàn)它是固著原纖維的主要成分，對表皮起連接和支持作用井與大皰性表皮松解癥的發(fā)生有關(guān)。VII型膠原為同三聚體，a鏈中氨基端向羧基端包括NCl(150kDa)、C0Ll(170kDa)和NC2(32或34kDa)三部分。COL1有1530個(gè)氨基酸殘基，長達(dá)424nm，其次是NC1,有1245個(gè)氨基酸殘基，包括1個(gè)軟骨基質(zhì)蛋白(cartilagematrixproteinCMP)序列，9個(gè)連續(xù)的纖連蛋白III型序列和1個(gè)vWFA型序列。膠原蛋白單體中NC1形成頂端有球狀結(jié)構(gòu)的三條臂、單體間經(jīng)NC2相互聚合形成二聚體，許多二聚體聚合就形成了固著原纖維。固著原纖維呈袢狀纏繞I、III型膠原纖維，兩端分別附著于真皮，表皮連接(dermo14‘epidermaljunction)的致密板和位于真皮乳頭層，主要中IV型膠原組成的固著張斑(anchoringplaque)并與半橋粒發(fā)生聯(lián)系。除皮膚外，VII型膠原及固著原纖維還存在于消化道等其他器官的上皮組織，參與細(xì)胞的分化、粘附和基底膜的濾過等功能。XIII和XVII型膠原二者并不同源性，但兩者有相同的結(jié)構(gòu)特征:?氨基端有跨膜區(qū)而無信號肽。?外顯子發(fā)生可變拼接(alternativesplicing)使其a鏈包括膠原區(qū)在內(nèi)呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)的多樣化。a1(XIII)肽鏈很短，包括3個(gè)膠原區(qū)和4個(gè)非膠原區(qū)，COL1、COL2、NC2和NC4的氨基酸殘基數(shù)目因可變拼接變化較大。膠原的產(chǎn)生以間充質(zhì)來源的細(xì)胞為主，分布廣泛，從胚胎到成人的多種組織都有mRNA表達(dá)。XVII型膠原最初發(fā)現(xiàn)于表皮的個(gè)橋粒，是大皰性類天皰瘡等疾病的自身抗原，a鏈有13個(gè)膠原區(qū)和14個(gè)非膠原區(qū)，氨基酸總數(shù)為1433。兩種膠原的結(jié)構(gòu)和功能還須進(jìn)一步研究。XV和XVIII型膠原XV和XVIII型膠原的發(fā)現(xiàn)較晚，同源性較高。二者還有下列共同點(diǎn):？膠原區(qū)很多，分別為9個(gè)和10個(gè)、?分了兩端都是大型球狀結(jié)構(gòu)、?糖胺多糖和寡糖結(jié)合位點(diǎn)多。？分布廣泛，以內(nèi)臟器官較多。XVIII型膠原的基因有兩個(gè)可變啟動子，其中一個(gè)啟動子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中編碼NCl的外顯子發(fā)生可變拼接，因此XVIII型膠原還有不同的亞類。組織中還存在由不同類型膠原聚合而成的異型原纖維（heterotypicfibril，己發(fā)現(xiàn)I型膠原與III、V、XII、XIV型膠原都可形成異型原纖維°II型膠原則與IX型和XI型膠原聚合成異型原纖維，其中XI型膠原形成原纖維的核心，IX型膠原位于表面，II型膠原是原纖維的主要成分。構(gòu)成異型原纖維的膠原蛋白還參與調(diào)節(jié)膠原原纖維的直徑大小。四、膠原提取物的分子量測量膠原提取物的分子量測量的常用方法（1）,,,（十二烷基磺酸鈉）凝膠電泳法蛋白質(zhì)分子量測定較多用的是,,,（十二烷基磺酸鈉）凝膠電泳法,這種方法最適宜的測定分子量是15000,100000的樣品,對低于10000分子量的水解蛋白不太適用。通過改進(jìn),用強(qiáng)電解質(zhì)離子為前導(dǎo)離子和拖尾離子,可對分子量低于10000的水解蛋白樣品進(jìn)行分子量測定。用,,,凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量的理論依據(jù)蛋白質(zhì)分子中同時(shí)含有羧基和氨基,羧基可給出氫離子,+,氨基可接受,+,故蛋白質(zhì)具有兩性性質(zhì)。蛋白質(zhì)中的羧基和氨基可互相作用形成雙極離子。在,+濃度大的溶液中蛋白質(zhì)以正離子存在;而在,,-濃度大的溶液中蛋白質(zhì)以負(fù)離子形式存在。若溶液的,,值為某一數(shù)值時(shí)蛋白質(zhì)以中性的雙極離子形式存在,這個(gè),,值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電點(diǎn)時(shí)因蛋白質(zhì)分子整體不帶電,所以在電場中不會移動。帶電蛋白質(zhì)分子在電場作用下將作定向移動,其移動的速度，可表示為：，二，？6n,n,?為分子（或離子）所帶凈余電荷,，為兩電極間電位差,，為兩電極間距離,，為球形分子的半徑，n為溶液的粘度。從上述表示式可知,在其他條件（電場、介質(zhì)粘度等）不變情況下,蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移速率受分子所帶凈電荷量與分子大小兩個(gè)因素的影響。如果兩種不同分子量的蛋白質(zhì)的分子大小的差異被所帶凈電荷量的差異所補(bǔ)償時(shí),則這兩種不同分子量的蛋白質(zhì)可以相同的速率電泳,這將無法通過電泳距離測定蛋白質(zhì)的分子量。為了解決這一問題,人們經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn),在,,,（十二烷基磺酸鈉）存在下蛋白質(zhì)的電泳速率和它們的分子量的對數(shù)成直線關(guān)系。其理由是,,,能與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)相結(jié)合并把絕大部分蛋白質(zhì)分離成它們的組成亞單位。,,,的結(jié)合還使變性的、隨機(jī)盤曲的多肽鏈得到大量負(fù)電15荷,這種負(fù)電荷基本上掩蓋了無,,,存在時(shí)正常帶有的任何電荷,就是說,使不同大小分子量的蛋白質(zhì)都帶上基本相同的電荷,所以使得蛋白質(zhì)分子的電泳速率和分子量的大小有了一定的關(guān)系:分子量大,泳動遷移率小;分子量小,遷移率大,具體為上述,,,—,直線關(guān)系。在用,,,凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)需同時(shí)至少用3,4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),這幾種蛋白質(zhì)的分子量有的應(yīng)高于待測蛋白質(zhì),有的應(yīng)低于待測蛋白質(zhì),使待測蛋白質(zhì)夾在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中間,從標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)得到的直線上就能找到待測蛋白質(zhì)的適當(dāng)位置,從而確定其分子量。實(shí)際進(jìn)行電泳時(shí)的電泳槽有圓盤電泳槽和板型電泳槽。我們選用板型凝膠電泳槽,此種電泳槽的優(yōu)點(diǎn)是便于對多種實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行比較,因?yàn)樗械臉悠范即嬖谟谕荒z中,各樣品的電泳條件是完全一致的。另外,操作起來簡便,易于進(jìn)行染色、脫色等泳后過程。（2）SDS,PAGE（SodiumDodecylSulfate,PolyacrylamideGelsElectrophoresis,十二烷基硫酸鈉，聚丙烯酰胺凝膠電泳）法1967年Shapiro提出用SDS,PAGE法測定蛋白質(zhì)的分子量。Bell研究了一種從蛋白質(zhì)混合物中辨別出膠原蛋白的SDS,PAGE分析方認(rèn)，這對膠原類蛋白質(zhì)的鑒定及其特性分析極為重要。Yoshihiro改變了SDS,PAGE傳統(tǒng)的染色方法，對膠原蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。其他學(xué)者在SDS—PAGE法分析人I型及III型膠原的結(jié)構(gòu)組成方而作了大量工作，得到了I型和III型人膠原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定了組織中I型和III型膠原蛋白的組分含量。國內(nèi)最早進(jìn)行膠原研究工作之一的第二軍醫(yī)大學(xué)曾用SDS,PAGE法研究豬皮中提取的膠原蛋白的分子量，雖沒有得到膠原蛋白準(zhǔn)確的分子量，并與人體血清蛋白進(jìn)行了比較。(3),,,-,,,(十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管凝膠電泳)法十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管凝膠電泳(,,,-,,,)是近年發(fā)展起來的一門新技術(shù)。和,,,-聚丙烯酰胺凝膠電泳(,,,-,,,,)相比,它具有微量、快速、定量準(zhǔn)確、易自動化等特點(diǎn)。在,,,-,,,中,高粘度交聯(lián)膠(如交聯(lián)聚丙烯酰胺膠)或低粘度非交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)(如葡聚糖、聚環(huán)氧乙烷、支鏈淀粉)可被用作篩分介質(zhì)。廖海明、楊昭鵬等:以葡聚糖為分離介質(zhì),線性聚丙烯酰胺涂漬毛細(xì)管柱為支持介質(zhì),柱上214,,檢測,進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。結(jié)果:被分離的蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)與其相對遷移率之間具有良好的線性關(guān)系(,=0997);涂漬毛細(xì)管柱可以使用多達(dá)100次而未出現(xiàn)分離效率的降低;同一毛細(xì)管柱和不同毛細(xì)管柱遷移時(shí)間的,,,分別小于10%和13%;用十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管膠電泳(,,,-,,,)方法測定的15種蛋白質(zhì)的分子量與用平板,,,-聚丙烯酰胺膠電泳(,,,-,,,,)測定的分子量具有良好的一致性。結(jié)論:毛細(xì)管電泳法可用于蛋白質(zhì)分子的分子量測定,它具有準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)。(4)激光微探針飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和基體幫助激光解吸質(zhì)譜(MALDI)法傳統(tǒng)的測定分子量及純度的方法,是應(yīng)用,,,聚丙烯酰胺凝膠電脈及高效液相色譜僅能給出表觀分子量,這些方法不僅受多種實(shí)驗(yàn)條件所限而且誤差相當(dāng)大,靈敏度也差,樣品用量大,且操作十分復(fù)雜,往往難以得到令人滿意的結(jié)果。,,,,， ,,,,,法在測定生物大分子分子量方面已成為一種強(qiáng)有力的分析手段,是常規(guī)測定大分子分子量方法所無法比擬的?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是80年代末發(fā)展起來的一個(gè)最新的質(zhì)譜學(xué)分支，特別是對生物大分子的分析方面有了重大突破。傳統(tǒng)的測定分子量及純度的方法是應(yīng)用SDS,PAGE凝膠電泳及高效液相色譜，這些方法不僅受多種實(shí)驗(yàn)條件所限，而且誤差大，靈敏度差，樣品用量大，往往難以得到令人滿意的結(jié)果。法元法比擬的。由于CaM具有相對較高的分子量，用傳統(tǒng)測定蛋白分子量的方法以及常規(guī)的質(zhì)譜難以對其進(jìn)行測定與研究，季怡萍劉淑瑩采用MALDI,toFMS法對CaM的純度與分子量迸行了分析與研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好、信息直觀等特點(diǎn)，是其它傳統(tǒng)測定蛋白質(zhì)分子量的方季怡萍劉淑瑩用,,,,， ,,,,,法快速測定天花粉蛋白分子量。儀器為,,，1700激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國,,,,16,,,;,,,,,,,;，,;),2激光器,激光波長337,,,質(zhì)譜信號為單次掃描累加,4加速電壓為30,,,吸引電壓9.3,,,檢測電壓-4.75,,,真空度為1.3X10,,，以正離子譜測定。基質(zhì)由美國,,,,,,,;,,,,,,,;公司提供:(1)100,,,,/,芥子酸(,,);(2)100,,,,/,2,5二羥基苯甲酸(,，，)；(3)30,,,,/,a氰基4羥基肉桂酸(a,,,)。質(zhì)量校正標(biāo)樣:，，，2503,蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品。將,，，樣品配成106,,,/，的水溶液吸取10口，置于小塑料管中，再加入10口，的基質(zhì)(分別做三種不同的基質(zhì))混勻，取1U,此溶液滴于進(jìn)樣探頭上，抽空除去溶劑,使樣品/基質(zhì)混合物在探頭上形成均勻的結(jié)晶,直接插入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。從以上結(jié)果可見,,,,，,,,,,技術(shù)不僅可以有效地檢測出,,,的準(zhǔn)分子離子峰,還伴有雙電荷峰及多聚體峰,而且分子離子峰最強(qiáng),這一特征便于確認(rèn)分子量。本實(shí)驗(yàn)對,,,進(jìn)行了測定,得到了準(zhǔn)確的分子量信息和純度信息。實(shí)驗(yàn)證明該方法在蛋白質(zhì)分子量、純度和雜質(zhì)測定中具有測量精度高、分析速度快、靈敏度高、分辨能力強(qiáng)、樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn),適用于研究初期測定產(chǎn)物的分子量、純度和雜質(zhì)情況,是測定稀少樣品的經(jīng)濟(jì)方法,是其它傳統(tǒng)的測定蛋白質(zhì)分子量方法無法比擬的。此項(xiàng)工作為進(jìn)一步研究,,,提供了重要信息。膠原蛋白分子量測量的常見錯(cuò)誤樣品量選擇不當(dāng):這是最常見的錯(cuò)誤。每一個(gè)樣品電泳分離時(shí),都應(yīng)該對同一蛋白濃度的樣品作不同樣品量的梯度測定,盡可能使每一條蛋白帶都呈現(xiàn)清楚。如果某一蛋白質(zhì)含量過多,往往可在它的遷移位置上“溢出”,即向兩端彌散,呈團(tuán)塊狀。像這種情況就不應(yīng)該以它的溢出范圍來定分子量。一個(gè)樣品可能有眾多的蛋白成分,電泳后,絕大多數(shù)的蛋白帶紋清晰可數(shù),也可能僅有某一蛋白成分量過多,呈團(tuán)塊狀,如分離血清蛋白時(shí),白蛋白帶往往見于此現(xiàn)象。這時(shí)若該蛋白質(zhì)成分比較重要,必須精確測出其分子量的話,這時(shí),可在旁邊一孔中加入更少量的樣品,使該一蛋白帶達(dá)到清晰滿意的程度。凝膠電泳時(shí),選擇,%和,%不當(dāng):這是操作者最易忽視的錯(cuò)誤。因?yàn)?在凝膠電泳時(shí),若選擇的,%和,%不合適,則形成的凝膠分子篩的孔徑會不一致,形成所謂有缺陷的分子篩。樣品在其中電泳時(shí),分辨率自然會降低,并可能會出現(xiàn)施尾現(xiàn)象。還應(yīng)注意到不同的實(shí)驗(yàn)室,分離或分析同一種生物某一蛋白質(zhì)時(shí),由于不同實(shí)驗(yàn)室的試劑,其純度、產(chǎn)家不同以及所使用的儀器規(guī)格、型號也不同,因此對他人成功的經(jīng)驗(yàn)只能作為重要的參考依據(jù),而不應(yīng)完全照搬,應(yīng)該結(jié)合自己實(shí)驗(yàn)室的情況摸索出最佳的實(shí)驗(yàn)條件。電泳方法選擇不當(dāng):自從1964年,,,,,利用盤狀電泳成功地分離了人血清以來,30多年中,該項(xiàng)技術(shù)已得到了迅速的發(fā)展。已由單一的盤狀電泳方式發(fā)展到垂直板型、平板型、超薄膜型等;電泳材料和技術(shù)已有瓊脂糖-,,,,、,,,-,,,,、等電聚焦電泳、梯度凝膠電泳、雙向電泳、凝膠免疫電泳、凝膠電泳印跡技術(shù)等多項(xiàng)技術(shù)。如若從測定蛋白質(zhì)分子量來說,一般認(rèn)為單一濃度的凝膠電泳、梯度凝膠電泳、單一濃度,,,凝膠電泳、,,,-梯度凝膠電泳,它們的分辨率是遞增的。作者可根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的條件、設(shè)備、技術(shù)掌握的成熟程度及實(shí)驗(yàn)?zāi)康目紤]選用。如若用單一濃度的凝膠電泳分不開的蛋白質(zhì),可使用其它幾種分辨率較高的凝膠電泳方法嘗試。但應(yīng)該注意到用,,,凝膠電泳系統(tǒng),蛋白質(zhì)分子已降解為亞基,將會影響到蛋白質(zhì)的免疫活性,尤其是分析酶蛋白時(shí),酶的活性喪失貽盡。這時(shí)可考慮改用等電聚焦電泳,它