中國核酸質(zhì)譜應(yīng)用專家共識

中國核酸質(zhì)譜應(yīng)用專家共識(最全版)面起到舉足輕重的作用。該領(lǐng)域檢測方法眾多，不同技術(shù)的優(yōu)勢及缺乏明顯。例如：熒光PCR檢測速度快，但是通量有限,無法便利快捷地滿足臨床對于多基因的需的技術(shù)平臺來填補該項空白。20世紀(jì)80年月消滅的基質(zhì)關(guān)心激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)打破了以往質(zhì)譜僅可進展小分子物質(zhì)分析的傳統(tǒng)［1,2］,一和約翰貝內(nèi)特芬恩于2002年獲得諾貝爾化學(xué)獎,美國食品藥品監(jiān)視治理局(FDA)于2014年批準(zhǔn)MALDI-TOFMS可用于臨床核酸檢測。本共識將通過介MALDI-TOFMS的原理、基因檢測原理及應(yīng)用等方面內(nèi)容，提高該平臺在—、MALDI-TOFMS原理后再經(jīng)過質(zhì)量分析器測定該樣品中不同種類離子的分子量，并依據(jù)從小到大的挨次依次排列從而得到一幅質(zhì)量圖譜。質(zhì)譜儀器平臺雖然種類眾多，但可以通過樣品進樣方式、離子源、質(zhì)量分析器等方面進展簡易分類。其中，MALDI-TOFMS承受的是樣品與基質(zhì)混合進樣，激光解吸方式電離以及飛行時間方法進展質(zhì)量分析。目前儀器靈敏度到達500fmol,承受標(biāo)準(zhǔn)樣品牛血清白蛋白(BSA)進展測50以上。1.基庾:MALDI-TOFMS需要基質(zhì)參與電離的過程，基質(zhì)多為具有很強激光能量吸取光對樣品的破壞?；驒z測所選用的基質(zhì)通常為輕基毗卩定甲酸(HPA)[4]O2?離子源工作原理：分子間收到的激光能量傳遞至樣品分子并使其電離。因此，MALDI技術(shù)屬于光子激發(fā)的外表解吸離[5]。另外,MALDI電離技術(shù)靈敏度極高，僅需pmol~fmol級別的微量樣本即可進展檢測。3?飛行時間庾量分析器(TOFMS)原理：1955年，2080，并常與MALDI品進展加速，然后不同分子量的離子在真空飛行管內(nèi)以各自不同的恒定速度飛向離子檢測器。由于真空管內(nèi)離子飛行速度與其質(zhì)荷比(m/z)的平方根成反比，不同質(zhì)荷比的離子到達檢測器的飛行時間不同，從而可以區(qū)分出樣品中具有不TOF0至無限大,100010000區(qū)間［6］。TOFMS區(qū)分率較低，主要緣由是當(dāng)時所承受的離子連續(xù)引出技術(shù)m/z離子間的動能存在差異［6］。后續(xù)WileyMclaren［7］ffi2050年月開發(fā)了延遲引出(DE)的樣品首先進入無場區(qū)，然后在幾百納秒或幾微秒的延遲后加上電壓脈沖引出離子，訂正了具有一樣質(zhì)荷比離子的能量離散，增加了TOF分析器的區(qū)分率。無MamyrinShmikk⑻提出了另一種承受反射器提高區(qū)分率的方法。該方法通過引入一個遲滯場可以偏轉(zhuǎn)離子并將其送回飛行管中，該遲滯場位于與離子源相對的自由場的后面，并將檢測器設(shè)置在遲滯場的一側(cè)用于捕獲被反射一時間到達檢測器，弱點相比,反射器對高質(zhì)量區(qū)離子同樣可以進展優(yōu)化,但代價是損失靈敏度和縮小1000~10000區(qū)間,屬于低質(zhì)量區(qū)，因此檢測時主要承受帶有延遲引出技術(shù)的線性模式。二、基因檢測單核苜酸多態(tài)性檢測：單核苜酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上由單個核苜酸的變異所引起的DNAt匕例＞1%［9］。單核苜酸多態(tài)性在遺傳疾病的診斷和篩查以及用藥種類及劑量指導(dǎo)等方面有著極其重要的作SNP檢測手段主要為Sanger測序、熒光定量PCR、SNP檢測的需求正在從單基因的有限幾個位點(如氯毗格雷用藥指導(dǎo)的CYP2C19*2*3兩個位點檢測[10]4個基因20個位點)[11]。所以，雖然上述現(xiàn)有臨床常用基因檢測技術(shù)在試驗操作、TAT時位點的檢測需求。相比之下，MALDI-TOFMSPCR1個反響SNP52個位點)[12],可極大的提高oSNPPCR和單堿基延長技術(shù)，其原理是首先通過PCRSNP的目標(biāo)片段進展擴増[口14,15],PCR完畢后加入蝦堿性磷酸酶(SAP)dNTP[16,17]然后在反響液中加入SNP延長引ddNTPSNP延長引物可SNP5端序列結(jié)合并延長一個堿基,依據(jù)不同的SNP模板可得到不同的延長產(chǎn)物。例如,SNP位點模板為胞疇噪(C),P票吟(G),SNP模板為腺P票吟(A),則延長胸腺腳定仃)[18]。該步驟完成后,反響液與樹脂混合進展DNAK+、Na+、Mg2+等離子，防止其干擾質(zhì)譜檢測結(jié)果。最終,反響液與基質(zhì)在靶板上結(jié)晶,進展質(zhì)譜檢測并得到圖譜[19]。由于各延長產(chǎn)物分子量不同,因此可以在各自的分子量位置查看是SNP分型。例如，假設(shè)在檢測結(jié)果的圖譜中可GT的檢測峰，則該樣品為G/TG檢測峰TSNPGGTT良30ppm5ng基因組DNA試驗選擇的全標(biāo)準(zhǔn)驗證技術(shù)為Sanger符100%。o基因突變檢測：EGFR突變?yōu)槔?其突變比例范圍可從＜1%至＞50%,因此該類檢測對于靈敏度、重復(fù)性等指標(biāo)要求高。以往臨床所使用的電泳、PCR、測序等方法需要通過染色顯色或發(fā)光基團AG、C、T4oSNPPCR、單堿基延長的方式對樣本進展處理并通過質(zhì)譜分析得到樣品譜圖[20]。SNP檢測不同的是，數(shù)據(jù)分質(zhì)譜譜圖中檢測峰的峰面積與樣品中該分子量所代表的核酸片段的含量呈正相0.5%[21]質(zhì)譜平臺特異性良好，使用國3x10-5,5ngDNA,可檢測到0.5%以上的突變樣本，比照試驗選擇的全標(biāo)準(zhǔn)驗證技術(shù)為突變擴増阻滯系統(tǒng)熒光定(ARMS-PCR)和同類型獲批的檢測產(chǎn)品，符合性＞95%。oDNA甲基化檢測：在人類基因組中，3%~6%DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用CpGC5位碳上形成共價鍵。CpG二苜酸在人類基因組中常以大小為300-3000bp的密集形式存在(CpG島)［22,23］,而這CpGCpG島的特別甲基化水平上升會抑制相關(guān)基因的表達，造成該基因所代表的蛋白質(zhì)［24］近年來,DNA甲基化在腫瘤硏究領(lǐng)域受到了極大的關(guān)注，特別是CpG因的激活已成為腫瘤硏究中的熱點問題［25］,DNA甲基化還與印記［26,27,28,29］。目前常見的甲基化檢測方法主要有測序［30］、PCR、熒光PCR等方法［31］。相比之下，質(zhì)譜DNA甲基化檢測，在引物設(shè)計、檢測本錢及數(shù)據(jù)分析等方面更加便捷、快速和準(zhǔn)確。其主要檢測步驟可分為4個局部，策一步是通過亞硫酸氫鹽反響對基因組DNACUC5T7啟動子序列的弓I物對目標(biāo)CpG島區(qū)域進展PCR擴增,并在擴增后參加蝦堿性dNTPRNA轉(zhuǎn)錄酶對擴增產(chǎn)物進展轉(zhuǎn)錄并在第四CA,CGGA之16DaC并通過各自的峰面積計算CpG位點甲基化比例,并估算整個檢測片段內(nèi)的平均甲基化水平［33］。由質(zhì)譜帶來的這種快速、準(zhǔn)確、定量甲基化檢測技術(shù)有助于推動腫瘤發(fā)生氣制的5%的甲基化水平，基因拷貝數(shù)鑒定：人類基因組中很多時候會消滅由于一段基因序列缺失或拷貝數(shù)增加而導(dǎo)致基因表達產(chǎn)物削減或增加的狀況，這種表型上的差異就是拷貝數(shù)變異(CNV)。CNVDNA1kbp3Mbp之間，并在基因組中分布廣泛。CNV在臨床上除了與罕見病和單基因病相關(guān)外，還與腫瘤等簡單疾病相關(guān)，因此對CNV變異的硏究可促進對多種疾病發(fā)病機制的認(rèn)知，從而指導(dǎo)疾病的分子診斷和治療方法的開發(fā)。MALDI-TOFMS可通過單核苜酸多態(tài)性等位基因比例(SAR)測樣本中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)進展定量分析，其原理是檢測待測拷貝片段中存在SNPSNP基因型拷貝的相比照值。高通量檢測結(jié)果驗證：高通量測序隨著時間的推移已經(jīng)逐步在臨床開展檢測效勞但何種技術(shù)最適合用于其結(jié)果的驗證工作至今尚未達成共識［34,35,36］。由于高通量測序的檢測靈敏度可達1% 5%,因此對驗證平臺的檢測靈敏度也提出了很高的要求。雖然此前曾有硏究小組將一代測序用于NGS的驗證工作,但其靈敏度對于低于15%的突變無法進展有效檢測，因此當(dāng)二者結(jié)果不一致時，質(zhì)譜多用于檢測結(jié)果的進一步驗證［37］。三、庾譜基因檢測影響因素1引物設(shè)計：PCR根底之上參加單堿基延長步驟的方法，PCR引物設(shè)計原則。引物長度范圍多為20~35bp,PCR100~200bp之間,GC40%~60%為宜并盡量避開引物本身產(chǎn)生發(fā)卡構(gòu)造及5個以上的瞟吟或噸喘核苜酸的連續(xù)排列。另外，由PCRSNP3,3個2?PCR及其他污染因素：PCRPCR檢測PCR污染的主要來源有標(biāo)本間穿插污染，PCR等，所以開展質(zhì)譜基因檢測的臨床試驗室應(yīng)具備標(biāo)準(zhǔn)PCR試驗室，建立試劑預(yù)備、標(biāo)本制備及PCR3格依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程進展樣本測時應(yīng)同時進展陰性和陽性比照試驗，準(zhǔn)時覺察問題。3?圖譜采集:最終的檢果形成的結(jié)晶不好因此在進展質(zhì)譜檢測前應(yīng)確認(rèn)樣本已完全結(jié)晶，并選取結(jié)晶均勻的區(qū)域進展檢多數(shù)100次左右的數(shù)據(jù)采集形成獨立圖譜加和的最終譜圖。4?數(shù)據(jù)分析：SNP數(shù)據(jù)分析時要留意雜合型樣本的推斷，理論1:1，實際檢測中兩峰間峰面積的差異應(yīng)12,低于此比例有可能代表存在污染,需通過陰性比照進行確認(rèn)。的基線進展比照并對該樣品進展復(fù)檢。5提高檢測質(zhì)量的方法：前處理樣本的選取:目前常用于單核苜酸多態(tài)性基因檢測的前處理樣本前處理樣本6h進展下一步提取或檢測在2~81周,-20°C16h6個月120工可保1年。石蠟包埋組織建議41周，長期保存可放置在低溫環(huán)境下。血1h內(nèi)離心，取上清馬上進展提取或冷凍保存。(2)DNADNA質(zhì)量掌握有兩種手段，第一種為常規(guī)的電泳手段，通?；蚪MDNA1.5%~2%DNA標(biāo)準(zhǔn)帶(Marker)MarkerDNA的量,跑出DNADNA濃度在最低檢測限以上，吸光度(A260/280)1.5~2.0之間。提取后的DNA2~81周，-20°1個月，-80°可長期保存,盡量削減凍融次數(shù)。(3)反響和純化:MALDI-TOFMS進展核酸檢測通常是通過多PCR的方法，通過單堿基延長的質(zhì)量差來分析延長的堿基,因此選取適合的酶和程序來保證明驗產(chǎn)物的量，在節(jié)約時間本錢的前提下盡可能地提高延長效控Na+、K+1個或多個鹽離子的質(zhì)需要在反響完畢后將試驗產(chǎn)物進展純化，去掉鹽離子，純化方式可選擇陽離子吸附樹脂純化。(