熒光法測定飲料中維生素C的含量

目錄TOC\o"1-5"\h\z1緒論 - 2-\o"CurrentDocument"1.1課題研究目的 - 2-\o"CurrentDocument"1.2飲料的簡介 - 3-\o"CurrentDocument"1.2.1飲料的概念 - 3-\o"CurrentDocument"1.2.2飲料的分類 - 3-\o"CurrentDocument"1.2.3中國飲料行業(yè)發(fā)展情況 - 3-\o"CurrentDocument"1.2.4飲料行業(yè)發(fā)展趨勢 - 5-\o"CurrentDocument"1.3維生素C簡介 -5-\o"CurrentDocument"1.3.1維生素C概念 -5-\o"CurrentDocument"1.3.2維生素C來源及性質(zhì) -6-\o"CurrentDocument"1.3.3維生素C的作用 -6-\o"CurrentDocument"1.4維生素C檢測方法簡介 -7-\o"CurrentDocument"2,6-二氯靛酚滴定法（還原型VC） -8-\o"CurrentDocument"紫外分光光度測定法 -8-\o"CurrentDocument"碘量法 -8-\o"CurrentDocument"2，4-二硝基苯肼法 -9-熒光光度測定法 -9-2實驗 -10-\o"CurrentDocument"實驗部分 - 10-實驗原料： - 10-2.1.2實驗試劑： - 10-\o"CurrentDocument"2.1.3實驗設(shè)備和儀器： - 10-\o"CurrentDocument"2.2實驗原理及熒光光度計的使用方法 - 11-實驗原理 - 11-F-2500熒光光度計的使用方法 -11-\o"CurrentDocument"2.3實驗方法 - 12-\o"CurrentDocument"試劑配制 - 12-\o"CurrentDocument"熒光化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜 - 13-\o"CurrentDocument"2.3.3影響熒光強(qiáng)度的因素 - 13-\o"CurrentDocument"標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定（線性相關(guān)實驗） - 14-\o"CurrentDocument"樣品測量的重現(xiàn)性實驗（變異系數(shù)的測定） - 15-\o"CurrentDocument"樣品回收率測定實驗 - 15-實驗結(jié)果與討論 - 15-\o"CurrentDocument"3.1影響熒光強(qiáng)度因素 - 15-\o"CurrentDocument"硼酸—醋酸鈉的影響 - 15-\o"CurrentDocument"醋酸鈉的影響 - 16-\o"CurrentDocument"標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果與分析 - 17-\o"CurrentDocument"3.3樣品的測定 - 19-\o"CurrentDocument"樣品重現(xiàn)性的測定結(jié)果與分析 - 19-\o"CurrentDocument"樣品回收率的測定結(jié)果與分析 - 21-結(jié)論 - 22-5討論5討論熒光法測定飲料中維生素C的含量羅義媛指導(dǎo)老師：王崇軍(重慶工商大學(xué),食品科學(xué)與工程,2008級食品班)摘要：本文建立了熒光分光光度法測定飲料中維生素c的含量的方法。方法是飲料經(jīng)草酸提取，活性碳氧化處理后，可氧化為順式脫氫型，此化合物的a-酮基與鄰苯二胺反應(yīng)形成喹喔啉，在激發(fā)波長340nm,發(fā)射波長424nm處測定其熒光強(qiáng)度。實驗結(jié)果表明維生素C在15?60ug/14ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9993。利用本方法進(jìn)行回收實驗與樣品測定，結(jié)果令人滿意，適用于飲料中維生素C的測定。關(guān)鍵詞：熒光光度法；維生素C;飲料FluorescenceSpectrometryDeterminationForVitaminCInSoftDrinkLuoYiyuanInstructor:WangCongjun(ChongqingTechnologyandBusinessUniversity,FoodScienceandEngineering,Foodclassof2008level)Abstract:ThisarticleestablishedafluorescencespectrophotometricmethodforthedeterminationofvitaminCinsoftdrink.Methodthebeveragewasextractedbyoxalicacid,afteroxidationtreatmentbycarbonoxidation,vitaminCisoxidizedtocis-dehydrogenatedtype,Thenitsa-ketonereactswitho-benzenediamineandproducesafluorescentcompound,Theoptimumexcitationwavelengthis340nm,andtheemissionis424nm,TheexperimentalresultsshowedthatthelinearrangeofthevitaminCwas15-60ug/14ml,relationshipcoefficientwas0.9993.Thepro-posedmethodcanbeusedinrecoveryandsampledetermination,whichwasfittedwelltomostbeverage.Keywords:fluorescencespectroscopy;vitaminC;softdrink1緒論1.1課題研究目的隨著人類生活水平的不斷提高，人們更加提倡合理的膳食結(jié)構(gòu)，除了每天攝入相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)以維持正常生活外，適當(dāng)?shù)难a充維生素也是必不可少的，特別是維生素C，維生素C又稱抗壞血酸，屬于水溶性維生素，它是人體所需營養(yǎng)素中六類物質(zhì)中一種，是維持正常生命過程所必需的一類有機(jī)物［1,］人體每天消耗量和排出量較高，但人體不能自身合成，必須從飲食中攝取，因此，合理的補充維生素C對人體健康至關(guān)重要，測定食品中的維生素C成為食品營養(yǎng)分析的重要內(nèi)容。市售的飲料中維生素C含量不盡相同，本實驗以市售三種飲料為檢測對象，對其維生素C的含量進(jìn)行測定，由于測定維生素C的方法比較多，但由于熒光法具有靈敏度高，線性關(guān)系好，精密度高以及不受其它熒光雜質(zhì)的干擾等優(yōu)點，故本實驗采用熒光法測定飲料中的維生素Co1.2飲料的簡介1.2.1飲料的概念飲料(drink,beverage)是指以水為基本原料，由不同的配方和制造工藝生產(chǎn)出來，供人們直接飲用的液體食品。飲料除了供水分外，由于在不同品種的飲料中含有不等量的糖、酸、乳以及各種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分,因此有一定的營養(yǎng)。1.2.2飲料的分類飲料一般分為含酒精飲料和不含酒精飲料(軟飲料)。酒精飲料是指供人們飲用且酒精(乙醇)含量在百分之0.5-65(V/V)的飲料，包括各種發(fā)酵酒、蒸餾酒及配制酒。不含酒精飲料又稱軟飲料，是指酒精含量小于百分之0.5(V/V),以補充人體水分為主要目的的流質(zhì)食品，包括固體飲料。軟飲料大致的種類有：碳酸飲料、果蔬汁飲料、植物蛋白飲料、礦泉水和純凈水、乳及乳飲料、其他飲料(三大傳統(tǒng)飲料：茶飲料、運動飲料、功能飲料)。1.2.3中國飲料行業(yè)發(fā)展情況中國飲料行業(yè)是改革開放以來發(fā)展起來的新興行業(yè),是中國消費品中的發(fā)展熱點和新增長點。30年來,飲料行業(yè)不斷地發(fā)展和成熟,逐漸改變了以往規(guī)模小、產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一、競爭無序的局面,飲料企業(yè)的規(guī)模和集約化程度不斷提高,產(chǎn)品結(jié)構(gòu)日趨合理。中國飲料在品牌方面的發(fā)展成果顯著，全國性品牌已有十幾家，五類產(chǎn)品中22個品牌被評為中國名牌。（1）飲料市場百花齊放，逆勢增長近幾年，中國飲料行業(yè)產(chǎn)值增長速度均超過GDP的增長速度，良好的發(fā)展前景，加之整個行業(yè)市場化程度較高，吸引了國際飲料巨頭紛紛進(jìn)入，競爭非常激烈。同時，近幾年來，我國軟飲料年產(chǎn)量以超過20%的年均增長率遞增，達(dá)到1300多萬噸。在產(chǎn)量增長的同時，品種也日趨多樣化，為消費者提供了更多的選擇機(jī)會。中國飲料行業(yè)逆勢而動，一邊是飲料巨頭加快擴(kuò)張，一邊是一批以具有健康概念、以獨特的農(nóng)產(chǎn)品為原料的新產(chǎn)品快速涌現(xiàn)。在飲用水市場，新品牌層出不窮，眾多企業(yè)紛紛推出瓶裝飲用水。除農(nóng)夫山泉的天然弱堿水、康師傅的礦物質(zhì)水、娃哈哈的純凈水外，可口、百事、匯源、達(dá)利園、今麥郎等企業(yè)也紛紛加大瓶裝水的推廣力度，借助自身的渠道優(yōu)勢吹響攻城略地的號角。同時，高端水的推出是2009年的一大亮點，知名品牌Heidiland、依云等都在高端水市場集中發(fā)力，坐享高額利潤。（2） 飲料市場三足鼎立之勢我國飲料市場始終是一個風(fēng)云變幻、群雄逐鹿的戰(zhàn)場。歷經(jīng)改革開放30多年的市場大潮，我國飲料市場已由當(dāng)年的“汽水”一張面孔，發(fā)展為由碳酸飲料、果汁飲料、茶飲料、功能飲料、含乳飲料等瓜分天下，果蔬、粗糧、大豆、咖啡等飲料尋求突破的市場格局。2009年以來，我國飲料市場更加紅火、熱鬧，形成茶飲料、果汁飲料、功能性飲料三足鼎立之勢，而在新興的細(xì)分市場內(nèi)，新老品牌輪流坐莊亦司空見慣。（3） 飲料行業(yè)的質(zhì)量現(xiàn)狀名牌產(chǎn)品質(zhì)量無需置疑，而且與國外產(chǎn)品沒有太大差別。名牌產(chǎn)品近幾年抽樣合格率100%（“中國名牌”產(chǎn)品銷量占總銷量近60%）?？梢哉f主流產(chǎn)品的質(zhì)量是非常優(yōu)秀的。但非主流產(chǎn)品的質(zhì)量還存在一些問題，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：1.少數(shù)產(chǎn)品質(zhì)量較差。不少飲料產(chǎn)品是故意偷工減料，比如在強(qiáng)化維生素、微量元素上不添加或添加不夠，在基本營養(yǎng)素、脂肪、蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)上很多產(chǎn)品達(dá)不到要求，有些產(chǎn)品衛(wèi)生指標(biāo)也達(dá)不到要求；2.存在劣質(zhì)假冒產(chǎn)。這樣的產(chǎn)品大多流向農(nóng)村和城鄉(xiāng)結(jié)合部，這些地方是監(jiān)管的薄弱環(huán)節(jié)；3.“誤導(dǎo)”性宣。在功能性飲料“誤導(dǎo)”性的宣傳下，很多消費者錯誤地認(rèn)為，功能飲料可以補充人體所需的所有營養(yǎng)物質(zhì)。但科學(xué)研究證明，在瓶裝水中添加幾毫克的維生素、微量元素制造而成的功能飲料，根本無法滿足人體對維生素等營養(yǎng)成分的全面需求，其作用在于只能起到進(jìn)一步補充人體養(yǎng)分的作用，而人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)只能從日常食物中攝??；4.運動型飲料營養(yǎng)成分?jǐn)?shù)據(jù)模。在眾多飲料企業(yè)紛紛涉足功能性飲料市場時，生產(chǎn)運動型飲料的企業(yè)占據(jù)比例最高，但是在產(chǎn)品標(biāo)簽上對所含的營養(yǎng)成分沒有標(biāo)出確切的數(shù)據(jù)，讓消費者消費得“不明不白”；5.違規(guī)添加添加劑或防腐劑超。2008年乳品行業(yè)發(fā)生了震驚全國的三聚氰胺事件，含乳飲料雖然未報道被檢出三聚氰胺超標(biāo)，但三聚氰胺事件對飲料行業(yè)來說最大的警示是不能違規(guī)添加添加劑。據(jù)報道，還有的企業(yè)在飲料中超標(biāo)添加苯甲酸鈉等防腐劑。有的飲料含有合成香料、色素，消費者飲用此類產(chǎn)品不僅會影響胃腸功能，而且會加重腎臟負(fù)擔(dān)，給其健康帶來了較大的影響。1.2.4飲料行業(yè)發(fā)展趨勢“十一五”期間，中國著重調(diào)整飲料產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，降低碳酸飲料的比例。飲料行業(yè)生產(chǎn)總量繼續(xù)提高，重點發(fā)展果蔬汁飲料、植物蛋白飲料和茶飲料等產(chǎn)品，適度發(fā)展瓶(罐)裝飲用礦泉水，逐步降低可樂等碳酸類飲料的發(fā)展。因此在利好政策的推動下，未來幾年將是軟飲料行業(yè)框架結(jié)構(gòu)重構(gòu)時期，功能飲料、果汁飲料、茶飲料等健康飲料將組成框架結(jié)構(gòu)的主體。追求健康價值，是未來中國飲料市場發(fā)展的必然方向。健康飲品占領(lǐng)市場的一個重要方面是產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新，“創(chuàng)新是企業(yè)的靈魂”。中國飲料企業(yè)在未來相當(dāng)長的時間內(nèi)將面臨更為廣闊的市場和更好的發(fā)展環(huán)境。1.3維生素C簡介1.3.1維生素C概念維生素C是顯示抗壞血酸生物活性的化合物的通稱，是一種水溶性維生素。在氧化還原代謝反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，缺乏它可引起壞血病。維生素C是可溶于水的無色結(jié)晶，是一種分子結(jié)構(gòu)最簡單的維生素。由于其防治壞血病的功能，所以在醫(yī)藥上常把它叫做抗壞血酸(ascorbicacid)。維生素C是一種具有六個碳原子的酸性多羥基化合物，是烯醇式己糖酸內(nèi)酯。其分

子中2位和3位碳原子的兩個烯醇式羥基容易解離，釋放出H+,因此維生素C是酸性的。維生素C有D（氧化型）型和L型（還原型）兩種異構(gòu)體，只有L型有生理功能。維生素C自身可發(fā)生氧化還原反應(yīng)，氧化型抗壞血酸和還原型脫氫抗壞血酸可以互相轉(zhuǎn)變，在生物細(xì)胞中自成一氧化系統(tǒng)，在體內(nèi)參與氧化還原反應(yīng)，羥化反應(yīng)，人體不能合成。化學(xué)名稱：L—抗壞血酸分子式：C6H806分子式：C6H806分子量：176.13結(jié)構(gòu)式:（2,3,4,5,6-五羥基結(jié)構(gòu)式:（2,3,4,5,6-五羥基-2-己烯酸-4-內(nèi)酯）1.3.2維生素C來源及性質(zhì)維生素c是最不穩(wěn)定的一種維生素，易被氧化。只有新鮮的蔬菜、水果或生拌菜才是維生素C的豐富來源。植物及絕大多數(shù)動物（除人、靈長類及豚鼠以外）均可在自身體內(nèi)合成維生素C。（注：1907年挪威化學(xué)家霍爾斯特在檸檬汁中發(fā)現(xiàn)維生素C，1934年才獲得純品，現(xiàn)已可人工合成）維生素C為無色片狀結(jié)晶，熔點為192°C，味酸，極易溶于水及乙醇，為水溶性維生素C。維生素C在酸性溶液中比在中性和堿性溶液中穩(wěn)定；極易受溫度、光照、射線、鹽和糖濃度、氧氣、酶、金屬離子（Fe3+和Cu2+）、水分活度等因素的影響，在加工儲藏過程中很容易被破壞。1.3.3維生素C的作用（1） 具有抗氧化作用，主要是抗細(xì)胞液、細(xì)胞間質(zhì)及血漿的氧化，也可以保護(hù)其它抗氧化劑，如維生素A、維生素E、不飽和脂肪酸，減少自由基對身體的損壞。（2） 預(yù)防壞血病，壞血病因缺乏維生素C所致，體內(nèi)V不足，微血管容易破裂，C血液流到鄰近組織。初期病癥為微血管出血：牙齦出血、皮下出血等，重者：口腔潰瘍，身體衰弱，嚴(yán)重死亡。（3）與蛋白質(zhì)結(jié)合，有助促進(jìn)膠原蛋白的合成，幫助創(chuàng)口愈合；有助于鞏固結(jié)締組織，保護(hù)骨骼、牙齒和牙齦健康。（4）預(yù)防動脈硬化，可促進(jìn)膽固醇的排泄，防止膽固醇在動脈內(nèi)壁沉積，甚至可以使沉積的粥樣斑塊溶解。（5）防止牙床出血，防止關(guān)節(jié)痛、腰腿痛。（6）治療貧血。使難以吸收利用的三價鐵還原成二價鐵，促進(jìn)腸道對鐵的吸收，提高肝臟對鐵的利用率，有助于治療缺鐵性貧血。（7） 防癌［2-3］。豐富的膠原蛋白有助于防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散；VC的抗氧化作用可以抵御自由基對細(xì)胞的傷害防止細(xì)胞的變異；阻斷亞硝酸鹽和仲胺形成強(qiáng)致癌物亞硝胺。（8） 保護(hù)細(xì)胞、解毒，保護(hù)肝臟。只要V充足，則V、谷胱甘肽、-SH形成有CC力的抗氧化組合拳，清除自由基，阻止脂類過氧化及某些化學(xué)物質(zhì)的毒害作用，保護(hù)肝臟的解毒能力和細(xì)胞的正常代謝。（9） 提高機(jī)體的應(yīng)急能力。人體受到異常的刺激，如劇痛、寒冷、缺氧、精神強(qiáng)刺激，會引發(fā)抵御異常刺激的緊張狀態(tài)。該狀態(tài)伴有一系列身體，包括交感神經(jīng)興奮、腎上腺髓質(zhì)和皮質(zhì)激素分泌增多。腎上腺髓質(zhì)所分泌的腎上腺素和去甲腎上腺素是有酪氨酸轉(zhuǎn)化而來，在次過程需要VC的參與。（10） 提高人體的免疫力。VC可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化性和變形能力，提高殺菌能力。促進(jìn)淋巴母細(xì)胞的生成，提高機(jī)體對外來和惡變細(xì)胞的識別和殺滅。參與免疫球蛋白的合成。促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生，干擾病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄，抑制病毒的增生?？偟膩碚f，維生素C（抗壞血酸）是人體內(nèi)不可缺少的基本營養(yǎng)成分。人體需要維生素C主要是由食品供給的，因此，測定食品中的維生素C含量是食品營養(yǎng)分析的重要內(nèi)容，同時也是評價食品貯藏、流動、加工過程中的主要指標(biāo)［4］。1.4維生素C檢測方法簡介維生素C（抗壞血酸）是人體必需兒又不能在體內(nèi)合成的一種維生素；由于它與多種疾病之預(yù)防和治療有關(guān)，早已引起人們普遍重視，隨著醫(yī)學(xué)與營養(yǎng)學(xué)研究的日益深入，對測定方法提出了更高的要求，而且維生素C的測定方法有很多，2，6-二氯靛酚滴定法［5-7］、2，4-二硝基苯肼法［8-10］、碘量法［11-12］、紫外分光光度法［13］、熒光法［14-15］等方法，但因熒光法具有靈敏度高，線性關(guān)系好，精密度高以及不受其它熒光雜質(zhì)的干擾等優(yōu)點，故以熒光法測定食品中維生素C已越來越為廣大分析工作者采用[16-1。7]1.4.12，6-二氯靛酚滴定法（還原型VC）原理：還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。本法用于測定還原型抗壞血酸，總抗壞血酸的量常用2，4-二硝基苯肼法和熒光分光光度法測定。它具有簡便、快速、比較準(zhǔn)確等優(yōu)點，適用于許多不同類型樣品的分析。缺點是不能直接測定樣品中的脫氫抗壞血酸及結(jié)合抗壞血酸的含量，易受其他還原物質(zhì)的干擾。如果樣品中含有色素類物質(zhì)，將給滴定終點的觀察造成困難。1.4.2紫外分光光度測定法原理：根據(jù)維生素C具有對紫外光產(chǎn)生吸收、對堿不穩(wěn)定的特性，在243nm處測定樣品液與堿處理樣品液兩者吸光度值之差，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計算出維生素C的含量。紫外測定法是維生素C快速測定的方法，操作簡單，不受其它還原性物質(zhì)等成分的干擾。由于食品樣品中所含有的其它成分在紫外區(qū)有很高的本底吸收，因此，還原型維生素C紫外光譜法很少用于食品分析。1.4.3碘量法原理：維生素C包括氧化型、還原型和二酮古樂糖酸三種。當(dāng)用碘滴定維生素C時，所滴定的碘被維生素C還原為碘離子。隨著滴定過程中維生素C全被氧化，所滴入的碘將以碘分子形式出現(xiàn)。碘分子可以使含指示劑（淀粉）的溶液產(chǎn)生藍(lán)色，即為滴定終點。滴定過程中，要保持緩慢滴定，同時要晃動錐形瓶。這樣既可以防止碘溶液過量，又可以使碘溶液與被滴定溶液充分混合。有時僅僅通過觀察顏色，不容易確定氧化還原反應(yīng)是否達(dá)到終點。2,4-二硝基苯肼法原理：總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2,4-二硝基苯肼作用生成紅色脎，脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進(jìn)行比色測定。2，4-二硝基苯肼法是比色法，易受雜質(zhì)干擾，靈敏度較低，而熒光法的靈敏度高于比色法2?3個數(shù)量級。另外，2,4-二硝基苯肼法采用85%的濃硫酸作溶劑，實驗時不易操作。1.4.5熒光光度測定法原理：樣品中還原型壞血酸經(jīng)活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺(OPOA)反應(yīng)生成具有熒光的喹喔啉(quinoxaline)，其熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度在一起條件下成正比，以此測定食物中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。脫氫抗壞血酸與硼酸可形成復(fù)合物而不與OPDA反應(yīng)，以此排除樣品中熒光雜質(zhì)所產(chǎn)生的干擾。本實驗采用F-2500熒光分光光度計，原產(chǎn)地為日本日立公司。要用來檢測熒光，散射光強(qiáng)度；其原理為某些特定的熒光物質(zhì)在受到光的照射時，除吸收各種波長的光以外，還會發(fā)射出波長相同或波長更長的光；后者又分熒光和磷光。F-2500熒光分光光度計如圖：2實驗2.1實驗部分實驗原料：樣品一統(tǒng)一鮮橙多（450ml）:成都統(tǒng)一企業(yè)食品有限公司Vc含量：25mg/100ml樣品二統(tǒng)一蜜桃多（450ml）:成都統(tǒng)一企業(yè)食品有限公司Vc含量：15mg/100ml樣品三達(dá)能的脈動（600ml）:樂百氏食品飲料有限公司Vc含量：20mg/100ml實驗試劑：水：全為蒸餾水鹽酸（AR,成都市科龍化工試劑廠）活性碳（AR,重慶博藝化學(xué)試劑有限公司）草酸（AR,上?；瘜W(xué)試劑總廠）硼酸（AR,重慶博藝化學(xué)試劑有限公司）醋酸鈉溶液（AR，成都市科龍化工試劑廠）領(lǐng)苯二胺溶液（AR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）vc標(biāo)準(zhǔn)溶液（重慶川東化工有限公司）硼酸—醋酸鈉溶液2.1.3實驗設(shè)備和儀器：F-2500熒光分光光度計（重慶普樂菲進(jìn)出口有限公司）CS1012型電熱鼓風(fēng)干燥箱（中華人民共和國重慶實驗設(shè)備廠）電子天平（梅特勒—托利儀器，上海有限公司）電爐（重慶海森機(jī)電設(shè)備開發(fā)公司）100ml燒杯（若干） 25ml容量瓶250ml燒杯（若干）50ml容量瓶500ml燒杯（若干）100ml容量瓶（兩個）100ml量筒（一個）250ml容量瓶（兩個）250ml量筒（一個）90mm漏斗2ml移液管（5根）25ml比色管（10個）5ml移液管（2根）150ml錐形瓶（4個）10ml移液管（3根）玻璃棒（3根）洗耳球（一個）濾紙（若干）2.2實驗原理及熒光光度計的使用方法實驗原理：試樣中的還原型抗壞血酸經(jīng)（AA）過活性碳氧化成為脫氫抗壞血酸（DHAA）后，再與領(lǐng)苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成有熒光的喹喔啉，其熒光強(qiáng)度與抗壞血酸的濃度在一定條件下是成正比的，以此來測定樣品中抗壞血酸和脫氫抗環(huán)血酸的總量；實驗中為消除其他熒光物質(zhì)（丙酮酸）的影響，加入硼酸（硼酸與脫氫抗壞血酸可形成不與鄰苯二胺反應(yīng)的絡(luò)合物），以此為空白實驗；樣品處理好后用熒光光度計測其熒光值，對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，從而得出線性相關(guān)方程。在其他條件一樣的情況下測定醋酸鈉和硼酸醋酸鈉的影響。在同等條件下平行做多組實驗進(jìn)行對比（變異系數(shù)的測定），判斷此方法的重現(xiàn)性是否良好。樣品中再加入標(biāo)準(zhǔn)品，測定其回收率，判斷其數(shù)據(jù)是否可靠[18-1。9]F-2500熒光光度計的使用方法：（1） 先打開儀器主機(jī)，打開電腦。（2） 點擊桌面FL—Solutions使其激活。（3） 尋找激發(fā)波長：放入樣品，尋找激發(fā)波長，點擊Method，出現(xiàn)對話框，點擊General，在Measurement中選擇wavelengthscan，點擊Instrument，在scanmode中選擇Excitation，在datamode中只選Fluorescence，在EMWL中輸入發(fā)射波長數(shù)值（420nm）。在EXstart中輸入激發(fā)起始波長（220nm）,在EXendWL中輸入激發(fā)終止波長（700nm）。點擊確定即可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜曲線。尋找發(fā)射波長：同上法。在scanmode中選Emission。在datamode中只選Fluorescence,在EXWL中輸入激發(fā)波長數(shù)值(350nm)。在EMstart中輸入發(fā)射起始波長(220nm),在EMendWL中輸入發(fā)射終止波長(700nm)。點擊確定即可得到熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜曲線。將樣品放入，在scanmode中選Emission。在datamode中只選Fluorescence，在EXWL中輸入激發(fā)波長數(shù)值(350nm)。在EMstart中輸入發(fā)射起始波長(220nm),在EMendWL中輸入發(fā)射終止波長(700nm)。點擊確定即可得到熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜曲線。記錄在424nm處的熒光值F。在完成測量之后,關(guān)閉儀器按下列步驟執(zhí)行。從文件菜單(F)中，選擇退出(X)指令。Oclosethemonitorwindow,butkeeplampoperating?Oclosethelamp,thenclosethemonitorwindow.選擇yes,FLSolutions程序?qū)⒔K止。關(guān)閉光度計的電源開關(guān)。關(guān)閉電腦，清洗比色皿，結(jié)束操作注：關(guān)燈：使用以上指令來關(guān)閉氙燈,為了再次打開氙燈,必須重新啟動光度計。狹縫寬度選擇為5nm。2.3實驗方法試劑配制：酸洗活性碳：取100g活性碳，以10%的Hcl500ml加熱煮沸5分鐘，以水洗滌三次(每次500ml),然后再120°C的烘箱里烘干備用。1%草酸水溶液：稱取草酸2.5g加水溶解，并定容至250ml備用。醋酸鈉溶液：稱取醋酸鈉125g，溶于水中，并定容至250ml備用。硼酸一醋酸鈉溶液：稱取9g硼酸，加入醋酸鈉溶液35ml使之溶解，再用水定容至100ml,使用前新鮮配制。領(lǐng)苯二胺溶液：稱取20mg領(lǐng)苯二胺溶于100ml水中，使用前新鮮配制且避光保存。V標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mgV以1%草酸定容至50ml，此溶液含V500ug/ml。CC，C

再把此50ml溶液至于150ml錐形瓶中，加入2g活性碳，劇烈振搖2-3min，稍靜置，過濾。取濾液1.5ml于25ml容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，此溶液含V30ug/ml.C熒光化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜啟動F-2500熒光分光光度計，選擇激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm，對維生素C與領(lǐng)苯二胺所形成的熒光化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行掃描。所得激發(fā)波長和發(fā)射波長光譜如圖1所示。O(EM),O(EX)10000遑9000書8000宅7000達(dá)6000書5000星4000巨3000_2000書1000書0Jnm300400500600700圖1EX為激發(fā)波長 EM為發(fā)射波長本文所選擇的激發(fā)波長為340nm,發(fā)射波長為424nm。2.3.3影響熒光強(qiáng)度的因素（1）草酸維生素C極易在空氣中被氧化尤其是在堿性的的條件下，而在酸性的介質(zhì)中它受空氣氧化的速度和程度稍慢，且較穩(wěn)定。本文用1%的草酸［20］水溶液作為實驗中維生素C的提取液，是為了減慢維生素C的氧化速度，也防止維生素C的氧化損失，也可以減少實驗的的誤差，使實驗數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。（2）活性碳

活性碳是很好的氧化劑和吸附劑［21］，其在此實驗中既起氧化作用將樣品中的還原型抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，也對飲料樣品起脫色的作用。所以適量的活性碳對實驗結(jié)果測定有重要作用，本實驗選擇活性碳的用量［22］為2g,能夠使測定樣品中維生素C完全氧化且吸附作用不是很明顯。實驗中還需注意樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中活性碳的加入量需要一致，這樣可以消除系統(tǒng)誤差。（3）硼酸—醋酸鈉取25ml具塞比色管①、②、③、④、⑤、⑥6管，各加入標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0ml,再各加入2.0ml硼酸—醋酸鈉溶液，搖勻，各放置0min,5min,10min,15min,20min,25min,然后立即于各管中加入鄰苯二胺溶液10ml（黑暗中加入），搖勻，在暗處放置40min后，用熒光光度計測定其熒光值（F）。平行實驗做三組。根據(jù)實驗得到相關(guān)數(shù)據(jù)，制表，判斷硼酸—醋酸鈉溶液加入后反應(yīng)時間對熒光強(qiáng)度的影響。（4）醋酸鈉取25ml具塞比色管①、②、③、④、⑤、⑥5管，各加入標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0ml（V加入量為60ug），再各加入2.0ml醋酸鈉溶液，各放置C0min,3min,6min,10min,15min后，立即在黑暗處各加入鄰苯二胺溶液10ml,搖勻，在暗處放置40分鐘后，用熒光光度計測定各管熒光值。平行實驗做三組。根據(jù)實驗得到相關(guān)數(shù)據(jù)，制表，判斷醋酸鈉溶液加入后反應(yīng)時間對熒光強(qiáng)度的影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定（線性相關(guān)實驗）取25ml具塞比色管①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧8管，分別取2.0ml，0.5ml,0.8ml,1ml,1.3ml,1.5ml,1.8ml,2.0ml標(biāo)準(zhǔn)溶液于各管中，用蒸餾水定容至2.0ml。再于①管中加入2.0ml硼酸酸一醋酸鈉溶液，（此為標(biāo)準(zhǔn)空白溶液），搖勻，放置15min后，再于②管到⑧管（此為標(biāo)準(zhǔn)管溶液）中加入醋酸鈉溶液，搖勻，在暗處立即于各管中加入鄰苯二胺溶液10ml,搖勻，于暗處放置40min后,在激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長424nm處測定各管的熒光光度值（F）。根據(jù)實驗得出相關(guān)數(shù)據(jù)，制表，制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（標(biāo)準(zhǔn)液各管F值減去標(biāo)準(zhǔn)空白管F值，以差值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)），得到工作曲線回歸方程。樣品測量的重現(xiàn)性實驗（變異系數(shù)的測定）取樣：取均勻樣品10ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸溶液10ml,用蒸餾水定容至刻度。氧化：將定容的樣品溶液倒入150ml錐形瓶中（如果溶液中有懸浮物或者沉淀，可通過棉花過濾于錐形瓶中），再加入2g酸洗活性碳，劇烈振搖2-3min后，稍靜置，然后將其倒入濾紙中進(jìn)行過濾，取此濾液5.0ml于25ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。此為樣品工作液。反應(yīng)：取25ml具塞比色管①、②，于兩管中加入樣品工作液2.0ml，再于①管中加入硼酸一醋酸鈉溶液2.0ml（此為樣品空白溶液），搖勻，放置15min后，于②管中加入醋酸鈉溶液2.0ml（此為樣品溶液），搖勻，在暗處立即于①、②兩管中加入鄰苯二胺溶液10ml，于暗處放置40min后，在激發(fā)波長340nm,發(fā)射波長424nm處測定其熒光值（F）。三種樣品同樣的處理方法和測定方法。做多組平行實驗，得到相關(guān)數(shù)據(jù)，制表，根據(jù)公式算出維生素C的含量，判斷其重現(xiàn)性。2.3.6樣品回收率測定實驗取維生素C含量10mg/100ml的標(biāo)準(zhǔn)品10ml于樣品溶液中，按重現(xiàn)性實驗過程方法進(jìn)行維生素C含量的測定。三種樣品同樣的處理方法和測定方法。做多組平行實驗，得到相關(guān)數(shù)據(jù)，制表，根據(jù)回收率公式進(jìn)行回收率的計算?；厥章使剑夯厥章剩ǎィ?［（加入標(biāo)準(zhǔn)品測得量一樣品測得量）F加標(biāo)量］X100%。3實驗結(jié)果與討論影響熒光強(qiáng)度因素3.1.1硼酸一醋酸鈉的影響表1加入硼酸一醋酸鈉溶液后反應(yīng)時間對熒光強(qiáng)度的影響

反應(yīng)時間Omin5min10min15min20min25min1組F值117.974.3165.2259.6758.9558.782組F值118.375.2265.1559.4359.0158.893組F值117.274.8365.7359.1658.9758.86平均值117.874.7865.3759.4258.9858.84本文實驗表明，作為掩蔽劑的硼酸—醋酸鈉溶液加入空白管溶液后的時間對熒光強(qiáng)度值有影響。從表1可知，硼酸—醋酸鈉溶液加入空白管后，必須放置15min后，熒光強(qiáng)度值才能夠降低到最低值，否則空白值會偏高，對實驗數(shù)據(jù)測定帶來影響。醋酸鈉的影響表2加入醋酸鈉溶液后反應(yīng)時間對熒光強(qiáng)度的影響反應(yīng)時間0min3min6min10min15min1組F值239423712342230122892組F值240523852347229822773組F值24152387235123042284平均值24042381234623012283本文實驗了當(dāng)維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0ml（維生素C加入量為60ug）時，醋酸鈉溶液加入后，加入鄰苯二胺溶液的不同時間對熒光強(qiáng)度值的影響。從表2可知，醋酸鈉溶液在加入后存在于溶液中時間越長，熒光強(qiáng)度值就越低，從而降低了方法的靈敏度。因此，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液或者樣品溶液中加入醋酸鈉溶液后，搖勻，立即在暗處加入鄰苯二胺溶液，可以提高方法的靈敏度，減少實驗的誤差。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果與分析表3標(biāo)準(zhǔn)曲線V/ml（標(biāo)準(zhǔn)液）F0值（空白值）F值A(chǔ)F值（相對值）0.559.43646.8587.370.859.431004944.57159.4312191159.571.359.4316011541.571.559.4318841824.571.859.4321982138.57259.4324152355.57根據(jù)表3，可繪圖3：

圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗所得標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，維生素C含量在15~60ug/14ml范圍內(nèi)有良好的線標(biāo)準(zhǔn)曲線2000值度強(qiáng)光熒光值■線性（熒光值）2000值度強(qiáng)光熒光值■線性（熒光值）1111110 20 30 40 50 60 70濃度(ug/14ml)性關(guān)系，其工作曲線的回歸方程為：y=39.798x—10.621,相關(guān)系數(shù)R=0.9993由于本法中維生素C含量在15~60ug/14ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，故本文采用直接定點比較法來計算樣品中維生素C總量網(wǎng)。(F-F)xCxV“門(1 2)X100\F-F)xV1式中：X樣品中抗壞血式中：X樣品中抗壞血酸含量，mg/100mlF——樣品溶液的熒光強(qiáng)度1F——樣品空白的熒光強(qiáng)度2F——標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度3F——標(biāo)準(zhǔn)空白的熒光強(qiáng)度4C——抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/mlV——樣品混合液總體積，mlV 吸取樣品的體積，ml1

3.3樣品的測定3.3.1樣品重現(xiàn)性的測定結(jié)果與分析表4統(tǒng)一鮮橙多重現(xiàn)性測定試樣（樣品一）F2F1△FV 含 量C(mg/100ml)139.2823812341.7220.88239.4123822342.5920.88339.8523762336.1520.83439.4423682328.5620.75539.5323862346.4720.92639.6623592319.3420.67739.5123852345.4920.91839.5923672327.4120.75V平均值C20.82S（標(biāo)準(zhǔn)偏差）0.091V%（變異系數(shù)）0.43%表5統(tǒng)一蜜桃多重現(xiàn)性測定試樣（樣品二）F2F1△FV 含 量C(mg/100ml)131.7815851553.2213.84232.3715781545.6313.78332.5515971564.4513.95431.3715821550.6313.82532.5115951562.4913.92631.7115891557.2913.88731.2815691537.7213.71832.1915741541.8113.74V平均值——C 13.83

S（標(biāo)準(zhǔn)偏差）0.085V%（變異系數(shù)）0.61%表6達(dá)能脈動重現(xiàn)性測定試樣（樣品三）F2F1△FV 含 量C(mg/100ml)126.9118341807.0416.11226.7718291802.2316.07326.5918391812.4116.16426.6518211794.3515.99526.7918401813.2116.16626.2718261799.7316.04726.3418181791.6615.97826.8818321805.1216.09V平均值C16.07S（標(biāo)準(zhǔn)偏差）0.071V%（變異系數(shù)）0.44%樣品標(biāo)識上維生素C含量分別為：25mg/100ml,15mg/100ml,20mg/100ml；實驗所測得維生素C含量為：20.82mg/100ml,13.83mg/100ml,16.06mg/100ml。實驗所得數(shù)據(jù)略小于樣品標(biāo)識上含量，屬于正常范圍。樣品的重現(xiàn)性（精密度）可由變異系數(shù)（V）來表示，由表4,表5,表6的實驗數(shù)據(jù)可知,所做的三種飲料的變異系數(shù)分別為0.43%,0.61%,0.44%,表明用此熒光光度法測定飲料中的維生素C含量的重現(xiàn)性是好的。

樣品回收率的測定結(jié)果與分析加標(biāo)量均為10mg/100ml表7統(tǒng)一鮮橙多回收率測定組數(shù)F1F2△F加標(biāo)后V含量cV含量c回收率(%)138.3434853446.6630.7320.8299.1238.6834933454.3230.7920.8299.7337.9734713433.0330.6120.8297.9438.5434893450.4630.7620.8299.4V=(30.73-20.82)/10X100%=99.1%V=(30.79-20.82)/10X100%=99.7%V=(30.61-20.82)/10X100%=97.9%V二(30.76-20.82)/10X100%=99.4%表8統(tǒng)一蜜桃多回收率測定組數(shù)F1F2△F加標(biāo)后V含量cV含量c回收率(%)132.9327012668.0723.7913.8399.6233.2216992665.7823.7613.8399.3333.1927162682.8123.9213.83100.9432.5227232690.4823.9813.83101.5V=(23.79-13.83)/10X100%=99.6%V=(23.76-13.83)/10X100%=99.3%V=(23.92-13.83)/10X100%=100.9%V=(23.98-13.83)/10X100%=101.5%表9達(dá)能脈動回收率測定組數(shù)F1F2△F加標(biāo)后V含量cV含量c回收率(%)127.1429762948.8626.2916.07102.2226.8729622935.1326.1716.07101327.0529482920.9526.0416.0799.7427.2329812953.7726.3316.07102.6V=(26.29-16.07)/10X100%=102.2%V=(26.17-16.07)/10X100%=101%V=(26.04-16.07)/10X100%=99.7%V=(26.33-16.07)/10X100%=102.6%回收率的測定：由表7，表8，表9的數(shù)據(jù)表明，三種樣品的回收率均在95%以上，故采用熒光光度法測定樣品中維生素C含量，其數(shù)據(jù)是可靠的。4結(jié)論本實驗采用熒光光度法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，得到回歸方程：y=3