考研科目,動(dòng)物生物化學(xué) 第17章 核酸技術(shù)

第17章核酸技術(shù)DNA重組技術(shù)基因操作的主要技術(shù)核酸技術(shù)的應(yīng)用生長(zhǎng)激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“碩鼠”（1）重要的工具酶（2）載體（3）DNA重組的過程1DNA重組技術(shù)（1）重要的工具酶

它能夠識(shí)別、切割雙鏈DNA分子中的特定序列，這些特定序列多數(shù)為反向重復(fù)序列，一般長(zhǎng)度是4、5或6bp。

①限制性內(nèi)切酶粘性末端：識(shí)別序列對(duì)稱軸，左右兩邊切開，形成凸出部分。

如

EcoRI:5’---GAATTC

CTTAAG---3’

5’－GGCC－3’3’－CCGG－5’HaeⅢ平頭末端：識(shí)別序列中間切開同裂酶：產(chǎn)生相同的切割，形成相同的末端同尾酶：識(shí)別不同的序列，形成相同的末端②DNA連接酶

相鄰DNA的5′磷酸基團(tuán)和3′羥基形成磷酸二酯鍵。目前使用的連接酶有兩種：大腸桿菌DNA連接酶：黏性末端連接；

T4連接酶：黏性和平齊末端連接。③堿性磷酸酶催化DNA和RNA5′－磷酸基團(tuán)水解，產(chǎn)生5′－羥基末端，減少載體自身的環(huán)化。（2）載體

能將外源DNA帶入宿主細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增或最終使外源基因得以表達(dá)的自主DNA，稱為載體（vector）。分為：

①克隆載體：用于基因的復(fù)制、擴(kuò)增、測(cè)序等；②穿梭載體：原核與真核細(xì)胞間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移；③表達(dá)載體：用于目的基因的表達(dá)。

（3）DNA重組的過程

①

目的基因的獲得

②

選擇和制備載體③將目的基因與載體進(jìn)行切割連接④將重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞

⑤

陽性克隆的篩選和鑒定

⑥D(zhuǎn)NA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)等研究目的基因克隆的基本過程①目的基因的制備直接從染色體中分離人工合成逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫

PCR擴(kuò)增②

載體的選擇和制備

原核生物常用的載體：質(zhì)粒和噬菌體；真核生物常用的載體：動(dòng)物病毒、酵母；穿梭載體：通常是指那些既能在真核細(xì)胞中繁殖又能在原核細(xì)胞中繁殖的載體。③目的基因與載體的酶切與連接④

重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞大腸桿菌、酵母、真菌及各種真核細(xì)胞、受精卵細(xì)胞都可用于重組。

轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染--------

（1）轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過噬菌體或病毒的感柒作用將外援基因?qū)爰?xì)菌的過程。（3）轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒為載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。⑤

目的基因的篩選和鑒定遺傳標(biāo)記法核酸雜交法PCR方法免疫學(xué)鑒定物理篩選遺傳學(xué)方法（表型）

利用載體的特殊標(biāo)記,如質(zhì)粒含有抗青霉素的基因，當(dāng)含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可在含有青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)菌在同樣的條件下不能生長(zhǎng)。分子雜交技術(shù)Southern-blot印跡雜交原理示意圖

菌落原位雜交23626③聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR,DNApolymerasechainreaction）DNA核苷酸序列分析

Sanger雙脫氧鏈終止法④酶切鑒定目的基因表達(dá)

⑥

3DNA技術(shù)的應(yīng)用

(1)DNA指紋技術(shù)(2)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物克隆

(3)基因診斷與基因治療

(1)DNA指紋技術(shù)(DNAfingerprint)

DNA指紋技術(shù)是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的遺傳標(biāo)記（geneticmarker）的方法。

遺傳標(biāo)記是指可用來區(qū)分不同群體或個(gè)體，又能穩(wěn)定遺傳的某些物質(zhì)。生物個(gè)體間的差異在本質(zhì)上是DNA的差異，因此DNA是最可靠的遺傳標(biāo)記。

①限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

（restrictionfragmentlength

polymorphism，RFLP）

真核生物的DNA分子很長(zhǎng)，在遺傳過程中DNA堿基由于替換、重排、插入、缺失等原因，在子代DNA中會(huì)引起差異形成多態(tài)性。

用一種限制性內(nèi)切酶去切DNA時(shí)，DNA分子會(huì)降解成許多長(zhǎng)短不等的片段，個(gè)體間這些片段是特異的，可以作為某一DNA的標(biāo)記，將這種方法稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。

在人體DNA文庫中發(fā)現(xiàn)的由9–70bp重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)排列而成的高變異區(qū)，稱為小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）。

所有真核生物基因組中還存在由2-6bp為重復(fù)單位的重復(fù)順序，因其重復(fù)單位比小衛(wèi)星短，稱為微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA）。

②

DNA指紋圖譜（DNAfingerprint）。

不同個(gè)體的多態(tài)性來源于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同。同一家族小衛(wèi)星重復(fù)單位含有相同或相似的核心序列，用某一小衛(wèi)星DNA作探針，可與同一或不同物種多酶切DNA片段雜交，獲得高度個(gè)體特異性圖譜稱DNA指紋圖譜。

人的DNA指紋圖譜DNA指紋圖譜的特點(diǎn)：

①一次能夠檢測(cè)十幾個(gè)、甚至幾十個(gè)位點(diǎn)的變異性，有效的反應(yīng)組織的特異性。

②具有很高的變異性。

③

DNA指紋圖譜譜帶從親代遺傳給子代，兒女的指紋圖譜中幾乎每一條的圖譜中找到。

④

DNA指紋圖譜具有體細(xì)胞穩(wěn)定性，從同一個(gè)體不同組織。③

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RandomlyAmplifiedpolymorphicDNA，RAPD）

是以9–10個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列作引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物電泳后紫外觀察，不同個(gè)體的圖帶差異明顯，如DNA指紋圖譜一樣。

(2)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物