腦內(nèi)重要神經(jīng)核團(tuán)及神經(jīng)生物學(xué)研究方法簡(jiǎn)介

腦內(nèi)重要神經(jīng)核團(tuán)及神經(jīng)生物學(xué)研究方法簡(jiǎn)介神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義（供浙江大學(xué)本科生使用）主編杜繼曾陳學(xué)群浙江大學(xué)玉泉校區(qū)神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)教研室編寫者牛晨穎王世君何俊俊周淑鄢丁學(xué)鵬張進(jìn)同學(xué)2004年九月十六日要覽系列（影印版）Neuroscience（神經(jīng)科學(xué)）課堂講授使用教材(英文）.f和BIOSSCIENTIFICPUBLISHERSLIMITED2000腦內(nèi)重要神經(jīng)核團(tuán)和神經(jīng)生物學(xué)研究方法簡(jiǎn)介esrneurosciencehdnucleinin編寫晨穎.實(shí)驗(yàn)的明白得神經(jīng)核團(tuán)的概念，解重要的神經(jīng)核團(tuán)；把握腦立體定位圖譜的使用方法；了解神經(jīng)生物究用。2.實(shí)驗(yàn)器材、試劑及實(shí)驗(yàn)材料刀注，%鈉(etailSdm依文氏藍(lán)(vnsBu，小鼠。3.實(shí)驗(yàn)步驟31的重團(tuán)重核P室旁核（上核Hpcps和具。PVN（室周）PeN）SON（視上）ME）Hpap（馬）

距前囟（）-0-20~320~18-4-4-8-2

中心線（）008005103005053

距腦背側(cè)（）50~.565~.585~.89.~1.032~.032實(shí)內(nèi)容a) 比腔麻gg；) 在顱骨后3m；c) 用微量注射入μl依鼠。) 顱。GerePaxnsandChalsWatsnTeRatBaninStroaiccodatsAdicrs64.江灣Ⅰ型腦定位儀的使用6.1腦定原理a)腦立體定位儀直。)直線體的則c)利動(dòng)顱面某剖同表深一構(gòu)對(duì)關(guān)，部確深的。)用立體以mm位述部構(gòu)的位。e)用一的屬，上夾成而稱夾用有維滑的電架極腦結(jié)。2使方法a)否在中處。b)裝上架假電極，用假電極測(cè)定耳桿中心的高度,然后將電極移到門齒板上緣,調(diào)整門齒板低須譜與的持。c)戊巴比妥腔醉4gg。)顱。e)按在埋。5.神經(jīng)生物學(xué)研究的常用方法研體六成技。1形狀方法學(xué)學(xué)受神動(dòng)法。7.11束路追蹤法學(xué)統(tǒng)的于9世體或軸突損害后的逆后研0紀(jì)0年代要段銀法變的化變維0紀(jì)0年代展aa，年Krtsn過化PHRP的積存不久式HRPPH可續(xù)在胺被示。除HRP。2組學(xué)組學(xué)應(yīng)與結(jié)免理測(cè)內(nèi)、及面原體分的與這特強(qiáng)度進(jìn)，廣為生和眾的研。著抗備隆廣展記技斷，組的更新不于差論究取大突破，而且也速。的和種多抗分化物某質(zhì)為入另種物內(nèi)，熒、蛋膠記種抗組片，抗細(xì)胞（C氰酸羅丹明（TITC，在熒光顯微鏡下可觀看熒光抗體抗原復(fù)合物。常用的酶是辣根過氧化物酶（horsraish,根提，是，3－氨基、苯胺DA）和H2O2P使DAB原合光鏡?？箼z的式種是當(dāng)即述記樣的原了合方作但不接接將抗第簡(jiǎn)稱物二先抗記理最成抗記合間的一原可抗個(gè)抗，它度，前外種標(biāo)抗供用。中的種過物過物物法（peoia-niexdsecopxS備HP記以P抗HRP以HRP標(biāo)記該由3酶分子與2個(gè)抗酶抗形P和P理，以B顯色，即可檢測(cè)抗個(gè)子近0穎（ii素H卵黃和肝中提取的一種小分子物質(zhì)（分子量244.31（an取量68kD的4可逆的復(fù)合物。生物素－親合素的應(yīng)用大致有三種方法。①標(biāo)記親合素－生物素法（labelled-boinmhLBP）個(gè)HRP素體抗），體連個(gè)分抗性阻胞的（過先物抗，將合合的素此多高性（brgdad-inmtoBB法：抗物抗合游素素體生搭，達(dá)到多層放大成效。③親合素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法（avidin-bitin-proxidsexmh,C，－AC復(fù)合二ABC檢靈成的ABC，。3雜（insituhbiiaon）內(nèi)A和DNA研胞某或質(zhì)表差原照單酸堿專一配對(duì)的RNA或DNA（re切細(xì)測(cè)RNA或DA看目的mA或A的存在利用大肝桿菌重組帶有目的基因的質(zhì)粒DNA補(bǔ)DNA探針(A酶消化制成線性DNA板體轉(zhuǎn)得義A探針(cDNA);，應(yīng)用DA合酸A和A有32、2P、H核熒、、辛射。學(xué)原交是體交和原交是遺、因體癌等體定達(dá)；物A在高銳特它疫學(xué)上一子探功表調(diào)劑當(dāng)手。2生理方法行法最常。.2行學(xué)方法行為學(xué)方法是建立在條件反射基礎(chǔ)之上于20初反成刺。成多統(tǒng)。巴甫洛夫及其學(xué)派射條叫性性)納skine，復(fù)步動(dòng)才通過自某活動(dòng)作得成射操差活差處動(dòng)通在地刺激作化應(yīng)作射在。2生學(xué)方法包腦、。生學(xué)源11步化。12ErlangeGasse了滿。。0橋HodginBrnten上的沖同，s和RenshaHodki人測(cè)經(jīng)實(shí)中出通把尖于μ內(nèi)極的大為的不差會(huì)被大路放注向。現(xiàn)在，注入細(xì)胞的膜。在基礎(chǔ),Neher1μ表面上，對(duì)微微阻錄A級(jí)的通離截手段Nehe獲得1術(shù)了臨對(duì)科論要。3生學(xué)方法泳學(xué)等驟驗(yàn)離制的法于HC和FCA如的手A體的作用強(qiáng)度。免疫及A優(yōu)鑒及的法。7.4生法產(chǎn)中的應(yīng)用有基因的分子克隆及PolymeraseChanReactoPCR、向傳等。.2RCR是利用耐高溫的DNA增A過PR從酸樣檢R技的DA，通過板DA在DNA聚合循環(huán)來的DA每的A產(chǎn)物經(jīng)變性后又成為板DN。的A以n指數(shù)形式累積的30，DNA就到的上萬。.2精病、突測(cè)定基因分關(guān)析系位一體個(gè)（病和坐減裂中交重組高位一后代會(huì)少，。覆適遺的坐系行析，找某緊鎖基而該染上位常傳坐有P、小衛(wèi)星坐標(biāo)、微衛(wèi)星坐標(biāo)及單核苷酸多態(tài)坐標(biāo)等。關(guān)聯(lián)分析是在可能的候選致病基因選傳位多在和之比得坐位引起因危。基因的分離與克在的或BC或d等文中到對(duì)應(yīng)過SS存基切按。5影像經(jīng)研用1運(yùn)算掃T）CT技術(shù)的是X，X光檢測(cè)器和運(yùn)算機(jī)系統(tǒng)。位于頭顱一側(cè)的X的XX光束的XX光和X顱作0度位點(diǎn)的放射密度換算成相應(yīng)的衰減系數(shù)，然后依照每一個(gè)位點(diǎn)的衰減系數(shù)大小用不同的黑白亮度來顯示CT、。2發(fā)層nnTomograph，ＰＥＴ）發(fā)層PoitonEmisionTomograph，ＰＥＴ）是核醫(yī)學(xué)進(jìn)展的一項(xiàng)新性志是學(xué)高。ＰＥＴ的專門作用是以成如11、358Ｆ全態(tài)研體）一。元，從核內(nèi)開釋出與一般電子一樣但電荷相反的粒子，即正電子。正電子是一種反物質(zhì)，從核內(nèi)放出后為511kv光子飛行方向上對(duì)置一對(duì)探測(cè)器，便能夠幾乎在同時(shí)同意到這兩個(gè)光子，并可推定光子發(fā)源（即正電子發(fā)射）點(diǎn)在兩控頭間連線上。通過圍繞360°排列的多組配對(duì)探頭，經(jīng)探頭對(duì)間符合線路檢驗(yàn)判定每只探頭信號(hào)時(shí)刻耦合性，排除其它來源射線的干擾，得到探頭對(duì)連線上的一維信息，再用濾波反投射方式，將信號(hào)按探頭對(duì)的空間位置向中心點(diǎn)反投射，便可形成與探頭組連線軸平行的斷層面與CT，層合探圖。在臨床中，當(dāng)由正電子放射性核素所標(biāo)記的示蹤劑（顯像劑）注入血流后，到達(dá)全身，集合在特定的器官或某一部位，通過對(duì)應(yīng)的探頭，采納符合線路技術(shù)，探測(cè)器從360°方向檢測(cè)不同部位的光子，記錄開釋出光子的時(shí)刻、位置數(shù)量及方向。顯像裝置繞人體旋轉(zhuǎn)，多角度采集，信息經(jīng)運(yùn)算機(jī)貯存，再通過影像重建原理獲得人體各部位橫斷、冠狀斷面和矢狀斷面影像。ＰＥＴ顯像儀的結(jié)構(gòu)或相理查。大多數(shù)PET性8氟-2-D一。正常腦組織、心肌組織、腎臟及膀胱組織由于高糖代謝的需要因而對(duì)ＦＤＧ攝取較多。其它一些組織如肝臟、肌肉和腸壁由于其糖代謝水平低，則對(duì)ＦＤＧ的攝取量較少，顯示出的ＦＤＧ活性水平1也低其它于PET研究的示蹤劑如[15HO可來測(cè)量部腦組、心臟腎臟的流量，18F-A、8FRFGT的線1劑量與T。3振（Maeicxncemgg,R）床構(gòu)的不認(rèn)識(shí)4年P(guān)auli還。16美國(guó)哈佛大學(xué)的Percell及斯坦福學(xué)的Bloch分別獨(dú)立地發(fā)覺磁共振現(xiàn)象并接收到核，12理獎(jiǎng)自Damadian11年的MR12年P(guān).C.Lautrbr用共軛攝的R。174。Radi。動(dòng)頻不。子這種間它矢其必核，能現(xiàn)。成受中頻各磁就實(shí)振的，案，究對(duì)象簡(jiǎn)由n，n，nz體的線面信量、S/一二掃變fouirtransfr）像。Stpofsteeoaicsureya) Theseetaicistuentisfxd.b) Toaheetheftskllpoito,theicsrbarwsadjstdabveinterauralzero.（accrigtotheinsrcinofbrainmp）.c) Micewereanesthetizedwithsodiumpentobarbital(40mg/kgbodyweight,i.p.)forstereotaxic.Comparedtoarat,thesulofameispaperthi.Theasrunthroughtheceledirectlybetweenthetwoears.Thus,itisveryeasytostrangleamousewithevenlightlyappliedearbars.Ifearbarsareusedonamouse,thesurgeonmustbeverywatchfultoseethattheyareinfirmlyenoughtoholdtheheadstable,andthattheanimalcontinuestobeabletobreaththroughtheentireprocedure.Tovdths,tresarchrsworkigoneuseanseyholder,andnotearbars.This,o,introducesseriousinstability,particularlyifthesurgeryisbacktowardthebrainstem,astheleveragetoeincrassthefrterbacktheworkisbeingdoe.Inbymeansreducdacc,andeanimalsneeded.AnalternativeistheCunninghamheadholderformice(orneonatalrats,whereasimilarsituationapplies)thatemployslight,smallplasticearbarsthatallowthesurgeontofeelthepressureofapplicationbetterthanwiththeheavystainlesssteelearbarscommonlyused.Theseallowearbarstobeuedsucsfllyonaultmc.d) Silstlgiecannulasareipltdintonucleusaccordingtobrainmas.ecnnlswerefxdtotheskllwthtreesrwsanddetlceen.NesErarzrov.BrgaEarbarzeroisthepointatwhichtheearbarsmeetinthecenterofthestereotaxicinstrumentwhennolisintle.Bregmaisanlyoccurrigpointontheskllwhererskllpltstindevelopment.BregmaiswhereanAPandananteriorMLsuturelinecross.It’spositionrelativetobrainlandmarkshasbeenshowntobequiteconstantintherat.Lamdaisasimilarpointlocatedmorecaudallyerbim,whereasecondLsutreliecrosesthemesuture.Anaasofsoicoiestmoynr-neeea.aylssdrarrdhehbr5mmbelowtheearcenter,asthezeroreferencepointandplane.Itwasnoticedthatthistiltedolderratsheadslessthanyoungerrats,andthatmostofthebrainwasfarawayfromthezeropointwheretheearbarsmet.Afewpublishedstudiesfoundgreateraccuracyusingbregmaandskullflat(bregmaandlamdaatthesaevetialcoodiat)asthefraeofrefrece,andthebrema/kulflatrefrececoorintesysemisusdinvitalyallstretxicataesavalaletoay.(theuser’gieofmyeuoab )6.摸索題41是請(qǐng)神。2提的？7.參考書徐叔云社民社科等社g小譜站brainma于站實(shí)驗(yàn)二顯微冷凍切片（Microtome鼠腦組織切片操作（Howtoopeateaicrtomeadctherainsetion）編寫王世君1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪溆脠F(tuán)SNPVN海PVN。立位。.實(shí)械：大小鼠大，手術(shù)械，顯冷凍片機(jī)，埋劑（水代替，大小鼠體圖譜。3驗(yàn)步：3. 安裝刀具全溫到0℃邊up和dn二劑,p度,dow,度)。. 從-0℃組或0℃冰中放1小目組織冷現(xiàn)形。. 用包埋劑（膠水代替）把組織固定在r。. 后退樣品固定器(specinholder),固定載物盤，并適當(dāng)調(diào)劑搖桿,使的上下左右都正。3.5. 打開不的。. etontinssadtrmthike（hl，開始切片（sectioning。開始的時(shí)候能夠選擇大一點(diǎn)的刀距（tmthke,10-50到度(cntins,2m。3. 當(dāng)：載靠輕。. 對(duì)比所團(tuán)有SONVN，（CACA2CA）。N：定N后，依一分左右始現(xiàn)N,并向向外,成。. 把腦片到0或-0。.清潔，。注意：切片機(jī)專門昂貴，請(qǐng)好好愛護(hù)，同時(shí)所有操作嚴(yán)格按照示范來，并在有老師的情形下操作。4.實(shí)驗(yàn)總結(jié)確定SONPVN馬,畫PVN。.問：在切片？并畫出顯現(xiàn)N時(shí)形。.參：.,.?nigadDil.il.eaeA.Kipl.hertban:Aalsoftheforebaindlersofthebrain.ThesdsBatmre,16..,,,.etnn.:c..Sidman,R..AngevineJ.B.Jr.Pierce,E.T.Atlasoftheebrainandsl.d...包新民，舒云立圖譜。板.劑secinthcnes,右大,左減小3.調(diào)劑timhces,右:增大左減小4.指燈處.進(jìn),盤.換setontcnss和thimthcnss9.選擇(slt):數(shù)(o),數(shù)(s)或者tl.顯屏:顯計(jì)數(shù)(u,總數(shù)()或者travl.置(re):重新設(shè)數(shù)從0始p和down:調(diào)劑切片機(jī)度AABm:0m，BBea:2，

BIeaa:31m示PVNIeaa:25m海馬OeaigIsrto:1.Setuptheandcolofmicrtmechaberto-2℃..eentfe-0℃adlaeitt20℃for1h.tobaacetetepeaue.3.enne..ekropnl..Setscinthcnesandtimigthcns,Unlcktehanwel,sctn.（ABC以P為例）ImmunocytochemistryforAVPpeptidesinratbrain編寫何俊俊一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饷庖呓M織化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理，熟練把握實(shí)驗(yàn)操作步驟。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理1981年美國(guó)科學(xué)家發(fā)明了抗生素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合體法copeABC法生蛋白是種糖白子量600量4和大0在AC法，級(jí)白-素-抗素化個(gè)C有20個(gè)，可生高染目前已廣泛應(yīng)用于組織抗原的檢測(cè)免疫電鏡凝集素組織化學(xué)及原位分子雜交中。免疫組織化學(xué)技術(shù)（）是指用免疫學(xué)原理（從組織細(xì)胞水平進(jìn)抗原和抗體結(jié)合，通過特異的抗原抗體反應(yīng)標(biāo)記上可見的顯示物系統(tǒng)來檢查細(xì)胞及組織上原位抗原或抗體成分的方法一樣認(rèn)為凡具有抗原性或半抗原性物質(zhì)都能夠用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)并顯示出來在光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡或電子顯微鏡下觀看其性質(zhì)定位還能夠利用細(xì)胞分光光度計(jì)圖像分析儀共聚焦顯微鏡等進(jìn)行細(xì)胞原位半定量測(cè)定免疫組織化學(xué)的顯著特點(diǎn)是特異性強(qiáng)因?yàn)槊庖邔W(xué)的差不多原理是抗原與抗“一的織胞抗原的特定示（agieaorsnP布vp異以DAB結(jié)果能夠表示avp的量。免織特特：免差理原的對(duì)”的結(jié)此免疫組理講一的細(xì)原定顯示角白(keratin)顯示上皮成分、A顯示淋巴細(xì)胞成分。只是當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)顯現(xiàn)交叉反應(yīng)敏銳性高在應(yīng)用免疫組化的起始時(shí)期由于技術(shù)上的限制，只有直截了當(dāng)法、間接法等敏銳性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、由AC法或SP抗體至抗原來越方便地應(yīng)用于常規(guī)診斷工作中。定位準(zhǔn)確、形狀與功能相結(jié)合：盡管聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法差不多廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷，但由于不能在組織和細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行明確的定位而限制了PCR在病理組學(xué)上應(yīng)用。免疫組則可組織細(xì)胞進(jìn)行原的準(zhǔn)確位，而能同時(shí)不同原在一組或細(xì)胞中行定觀看如此能夠進(jìn)行狀與能相合的究，于病學(xué)研的深是十分有義。三、實(shí)驗(yàn)器械免疫濕盒、滴管、剪刀、保鮮膜、進(jìn)口膜parafil、4度冰箱37度培養(yǎng)箱、移液槍及槍頭、酶標(biāo)筆PA、Apendoff管及管架、燒杯、光學(xué)顯微鏡四、實(shí)驗(yàn)所需藥品一抗VP抗血清、二抗（依照一抗血清而定、三抗（生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶卵白素BS緩沖（PH7.410%清0.4%Tritox-1000.3%過氧化氫固定（4%多、、DA（顯色劑）五、試劑配制10.01MPB（pH=7.）500mlNa2HPO4NaH2PO4NaCl

2.9009g0.2964g4.25~4.50g溶于去離子水，調(diào)劑pH值至7.，定容至500m。24%多聚甲醛固定液40ml稱取1.6g多聚甲醛，以0.01MPBS(pH7.4稀釋至40m。30.4%Triton-X100/0.01MPBS50ml取Triton-X100200u，以0.01MPBS(pH7.4稀釋至50m。40.3%H2O2/0.01MPBS40ml取30%H2O2400u，以0.01MPBS(pH7.4稀釋至40m。5一抗稀釋液1%BSA/0.4%Triton-X100/0.01MPBS20ml稱取0.2gBS，以0.4%Triton-X100/0.01MPBS稀釋至20m。6二抗稀釋液1%BSA/0.01MPBS20ml稱取0.2gBS，以0.01MPBS稀釋至20m。（備注BS：牛血清白蛋白）六、實(shí)驗(yàn)步驟1、將實(shí)驗(yàn)用試劑從4度冰箱取出，自然平穩(wěn)至室溫；2、將腦片-20/-80度冰箱中取出，自然平穩(wěn)至室溫。3、用酶標(biāo)筆在腦片周圍畫圈，防止液體在玻片上溢流。4、4多聚甲醛固定30mi。5、0.01MPBS洗5minX3次。6、0.4%Triton-X100/0.01MPBS洗10minX1次。7、0.01MPBS洗，5minX3次。8、0.3%H2O2/0.01MPBS洗10minX1次。9、0.01MPBS洗，5minX3次。10以10%山羊血（110以0.01MPBS稀釋37度恒溫箱放置30min一樣以40ul/腦片為宜。11、傾去封閉血清液，略干，加一抗，4度冰箱放置過夜。12、0.01MPBS洗，5minX3次。13、加二抗（1：200稀釋度，37度恒溫箱放置1h，一樣以40ul/腦片。14、0.01MPBS洗，5minX3次。15、加三抗（1：300稀釋度，37度恒溫箱放置1h，一樣以40ul/腦片。16、0.01MPBS洗，5minX3次。17DAB（B配置1ml加1滴A加1滴B再1滴C，約n。七染色圖參考（PVN區(qū)域）八注意事項(xiàng)1.內(nèi)源性生物活性及其排除的用AC而產(chǎn)生非特性染色。含內(nèi)源生物素或物素樣質(zhì)較豐富組織，應(yīng)用C以1和1用0以用PBS洗5分鐘換3次。此外最近已有從鏈霉抗生素蛋（streptavidin由于其分子中不含寡糖及等電點(diǎn)接近（6－6.5，故非特異性吸附專門低。同時(shí)鏈霉抗生素蛋白可與長(zhǎng)臂生物素及過氧化物酶結(jié)合成復(fù)合物，此為SABC（streptavidin-Biotin-peroxidaseComplex）復(fù)用SBC取代ABC比AC高約20非在SAC已有的出SC法操差與C用SBC代替AC標(biāo)記，立即SAC試劑盒中的A液、B液各取10微升，加入1ml的PBS中（前配忙片室育30分鐘此第級(jí)抗和二抗的孵時(shí)均縮短至30故SC法個(gè)、敏非性的方。2.生制相性專在用C，。.。.在DAB顯中等子使物黑用綠，可陽的度靈。5、用PBS緩沖洗程沖全表留。6、準(zhǔn)確配比抗體的濃度，因?yàn)闈舛冗^高和過低都不利反應(yīng)地進(jìn)行，在滴加抗體的時(shí)候，做到用量少而平均。7DAB是有毒試劑使用過程中盡量不污染周圍環(huán)境同時(shí)顯色過程中盡量幸免DAB見光分解。8、滴加每種試劑做到迅速準(zhǔn)確，以免片子在反應(yīng)中干燥。9ABC試劑儲(chǔ)存溫度以4度為佳據(jù)報(bào)告儲(chǔ)存達(dá)兩年之久仍能獲得中意成效，而在-20度，生物活性在短期內(nèi)即被破壞。九提出問題1、實(shí)驗(yàn)?zāi)X片中存在的是什么，是抗體，依舊抗原？2、假如所檢測(cè)的物質(zhì)不是AV而是其他物質(zhì)那改變的是什么一抗二抗，依舊三抗？3、滴加雙氧水的目的是什么？十參考文獻(xiàn)1GolamMohammadIqbalChowdhury,TakashiFujiokaandShojiNakamurInductionandadatatonofFosexpressionintheratbrainytwotysofaeritstressBrainreserchBulletn,Vl.5,N.3,pp.71–182,2002、S.Lacas-Gervais,aD.Maurel,bF.Hubert,fA.M.Allevard,cA.Doukary,dV.Maggi,cP.Siaud,bC.Gharib,cB.Sicard,d,eA.Calas,aandH.Hardin-Pouzeta,VasopressinandgalaninexpressioninthehypothalamusoftwoAfricanrodent,TaterllusgracilsandSteaoyscaurinus,subjectedtowater-restriction,GeneralandComparativ Endocrinology133(2003)13–1454、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，汪謙主編，人民衛(wèi)生出版社1997染色步驟英文對(duì))1.4%Polyformaldehydefixup30min2.PH7.40.01MPBS-bufferwash3times,10minpertime3..4%rionx-10/.1MPSixp10min4.BSwsh3ies，10mnertme5..3%H2O2/PBS，roomemertre0mn6.onionwaerwsh3ties，1-2mnertme7..0MPS-ufer2ties，5minprtie8.ropsrum（thesaeseondatioy，cutreincutrebox1-2mn9.ropfrstntboy（1：500，1％BSA04%rton-100.1PBS，keepinieboxvernght（18-24hour）10.PBSwash3time，5minpertime11.ropbitie-ecodntbo（12001％BSA0.1MBSkepnultreoxabot0mn12.BSwash3ties，5minpertie13.ropthrdaniboy（1：3000.1mPS，eepincutuebox abot0mn14.PBS3times，5minpertime15.dopA，reaction20min16.non-ironwaterwash3times17.PBSwash實(shí)驗(yàn)四顯微圖像分析儀(Optimas6.0)的操作及原理Howoanipulatethemicro-imageprogram(OPTIMAS.5MediaInc,SilverSpring,Md,USA)編寫周淑嫣實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私獠盐彰庖呓M化實(shí)驗(yàn)中圖象捕捉及分析的原理、過程。實(shí)驗(yàn)器械光學(xué)顯微鏡PixeLINK數(shù)字?jǐn)z像頭電（操作系統(tǒng)windows軟件optimas）4.1圖象捕捉4.1.1數(shù)字?jǐn)z像的成像原理數(shù)字?jǐn)z像的原理和傳統(tǒng)的膠片攝像原理不同。傳統(tǒng)膠片的攝象的差不多原理是：涂有溴化銀晶體的感光層受光后結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生潛影，通過化學(xué)方法顯影工藝使?jié)撚坝跋蟮玫焦潭ǎ洳僮鞴に噺?fù)性多。件D式。CD表面按一定排列順序布滿片是CCD片按B（紅、綠、藍(lán)）三個(gè)基色為一個(gè)象素單元整齊排列的，不象溴化銀顆粒那樣雜亂無章成D盡管代。攝像頭的（LENS）生成的光學(xué)圖像投射到圖像傳感器表面上，然后轉(zhuǎn)為電信號(hào)，通過A/D（模數(shù)轉(zhuǎn)換）轉(zhuǎn)換后變?yōu)閿?shù)字圖像信號(hào)，再送到數(shù)字信號(hào)處理芯片（DP，DIGALSINLPROCSNG）中，DSP通過系列雜的數(shù)算法運(yùn)，對(duì)字圖像信號(hào)參數(shù)進(jìn)行把通過UB接口傳輸?shù)诫娔X中，經(jīng)處理，通過顯示器就能夠圖。4.1.2免疫實(shí)驗(yàn)中圖象捕捉的原理將染色玻片用顯微鏡觀看后，所成圖象的光學(xué)信號(hào)被顯微鏡上聯(lián)接著的數(shù)字?jǐn)z像頭接收。如上一節(jié)所述，攝像儀中的CCD將光學(xué)信通過與電腦主機(jī)相聯(lián)的數(shù)據(jù)線，傳送進(jìn)電腦，并由特定的軟件解碼重整，以所見即所得的圖片形式顯中供。圖為pixek數(shù)字?jǐn)z像頭4.2圖象分析4.2.1圖象分析的差不多原理在以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)原理的免疫組化實(shí)驗(yàn)中，由于不同實(shí)驗(yàn)條件阻礙下抗原量的不同，會(huì)使不同動(dòng)物同一區(qū)域組織片的染色圖片出現(xiàn)色彩深度上的差異。在圖象分析中，如此的色彩深度差異即表現(xiàn)為單位面積灰度積分值的不同。圖象分析的最終目的，即是依照染色深淺導(dǎo)致的灰定件。4.2.2數(shù)字圖像中的兩個(gè)差不多概念灰度模調(diào)多256級(jí)灰圖像每個(gè)像素個(gè)(色)~25(色。RB顏色式B顏色模式是運(yùn)夠用紅(R)綠)藍(lán))三種色光按不同比。在免疫組化的實(shí)驗(yàn)分析中，從顯微鏡下得到的是ＲＧＢ模式的圖片，而在數(shù)據(jù)分析中，為求灰度值，我們要將ＲＧＢ模式的圖片轉(zhuǎn)換成灰度模式。4.2.３Optimas6.5圖為optimas軟件的界面4.2.3.1使用optimas的一樣程序Opimas軟件的功能是比較強(qiáng)大的。它要緊被運(yùn)用在圖象分析上，其過程包括圖象的獵取、強(qiáng)數(shù)。第一是獲得PS能、X被optimas使用。我們應(yīng)該選擇好自己的圖象獵取工具，同時(shí)在正式使用之前進(jìn)行測(cè)試，看其獲得的圖象是否足的。，無法辨認(rèn)，同時(shí)這問題不能用亮化圖象解決，我們就能夠使用圖象強(qiáng)化這一功能。使用這系列功能OAS中，和。第三個(gè)步驟是選定待分析區(qū)域。也確實(shí)是區(qū)域界定，通過這一步驟，我們將在整個(gè)圖象中界定出一塊區(qū)域測(cè)區(qū)在OPTIMAS中，類型。我們能夠用工具欄或浮動(dòng)欄中的工具選定區(qū)域。選量OAS中含有專門多種測(cè)量工具，供我們選擇，甚至能夠?qū)D象的密度值映射到現(xiàn)實(shí)世界中的現(xiàn)象，諸如輻吸。報(bào)，IS軟cl輸意。最后，我們能夠使用軟件中的宏工具，記錄自己常需要進(jìn)行的一系列操作步驟，運(yùn)行它，便能化，。eessThistopcdicusesthefiegenealstpsinthepresofusingOPIAStoeiags.tgivessomebasicpointersandtechniquesthatshouldhelpyoubecomeproductivequickly.Thefivestepsaebeydsidblw.lkonasptogooaflrdcsonfi.p:eneImageacquisitionisthefirststeptowardscollectingdata. OPTIMAScansupportimageacquisitionmfiles,scanners,infrredce,ydevices,scanningernmircps,veocaersextenerally,anydevicethatcanbeattachedtoacomputer. Youshouldselectyourinputdevicebasedonhowwlitcapurestheimgsuwattoanalyz.tisworhwiletoperformsmetetsorcomparisonstoensurethatyourimagecapturedeviceisdeliveringthequalityofdatayouneed. unoftenreceivedemonstrationsandtestsofimagecaptureequipmentfromlocalrepresentatives,suchasyourdS.p:eeeeenacmettechniuesaressneesrytocoretprblmswiththei. ymttedygdsumygefeatuesyuwtomeasuresholdbeaddessdwihimgeenhncmettn.Inconsistenciesintheimagethatwouldpreventfromaccuratemeasurementsshouldalsobecorrcte. ohelpcrtsuchprbm,PSprvdsaoftoos,chs,mopooialtasors,adoprtos.p:sftFteidenifctinistheprocessoflaelngthepartsoftheimgefrmwhchwilmaret. InOPTIMAS,featuresaremarkedwithpoints,lines,orareas. YoucanmarkfeaturesorthroughthetoolsontheDatatoolbar.Youcanalsousemarkerflagstofetuesinpont,line,andares.p:esdtsMaretincldeseprcssofclirtn,meu,dfgd.OPIMASinldespoerulcairaintoolstatalowtosletrea-ordmeasreentunt,adjstmesueenstoofstimaedistrin,andscaeimaealestorea-ordpheomeasuchasere,dcilsi.rrepotigmuetresls,PSosainterace. ereommndtheuseofMicrsotbecaseincudsAutmaton contolcapabiliiesthtmakeittolinkOPTIAStoanworkhet. oe,entidoOPTIMASgivescompletecontrolovertheformattingofdatafilessocandesignthemtoberadporms.p:ekucnameapplctonrecordigandedingscrpsofOPTIMASc.Amtgokiseaeeuetdesmnrrndpvs42在免疫組化結(jié)果分析中Optms的幾個(gè)關(guān)鍵工具當(dāng)os被果有具提。（1）目標(biāo)區(qū)域選擇工具 ：用鼠標(biāo)點(diǎn)擊這幾個(gè)工具后，在圖上拖動(dòng)，能夠不同的形己，不形。（具 ，0表5調(diào)劑域值時(shí)，電腦依照我們選定的值的范疇，選擇符合的圖象區(qū)域，被選中的區(qū)域稱為前景，出現(xiàn)黃被是。、鼠標(biāo)移動(dòng)，或者手己。（3）自動(dòng)區(qū)域查找工具 ：設(shè)定域值后，點(diǎn)擊此工具，軟件會(huì)依照域值在目標(biāo)區(qū)內(nèi)小我。（置：可在此。（具相。4.3實(shí)驗(yàn)過程：整：4.1，在染色片置于。4..在optimas中打開。3，。4.4，選如pvn區(qū)或sn區(qū)。5，域。6，。4.7，到el里。48在excel里運(yùn)算自己所需的目標(biāo)區(qū)，出計(jì)表。4.4問題：（1）。（2）在圖0和255分？（3）出ops分析圖象差不多步驟。4.5參考文獻(xiàn)：（1）（ :t.n.ethth.t）（2）optms65件（3）Walker.c.ds.ut.mnaedeosfnrFdPsngslenfnfesdtherfucioalimorane.[JonlAtl]JournalfNernoiog.91)2-4,1997Jan.實(shí)驗(yàn)五成年小鼠空間學(xué)習(xí)經(jīng)歷的檢測(cè)―Morris水迷宮AdultMicePerformance（LearningndMemoryFunctin）nsre寫鵬1的：1．1了解水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)經(jīng)歷的原理1．2把握水迷宮的操作方法及檢測(cè)軟法2，實(shí)驗(yàn)器械：置頭腦水：或鼠3，實(shí)理容:Mr迷（Morswarmae,MWM學(xué)的習(xí)歷力。為MorRihrdors量大鼠的一個(gè)空間學(xué)習(xí)能力徑是2的亮在6找面宮境那確方。夠把臺(tái)個(gè)中宮每的在上3一臺(tái)夠進(jìn)檢測(cè)。Morriswater(MWM)Thewatermazeconsistedofablackpool(1mindiameter,50cmhigh,poolbottom45cmabovefloorlevel),filledwithwater(opaquewithink),andablackplatform(11cmindiameter,30cmhigh)submerged1cmbelowwatersurface.Thewaterwasmaintainedat21±1℃,andtheplatformwasplacedineitheroffourvirtualquadrantsat30fromthesidewall.Experimentalroom(2.4×2.4×32containscues:apole,doand.movementsofmicewererecordedwithavideocameraconnectedtoacomputer.Datawereanalyzedusingatrackingprogram(DigBehv-MWM,ShanghaiJiliangSoftwareTechnologyCo.Ltd.China).Testingtookplacebetween0800and1300hours.Onedaybeforetraining,themicewereallowedtoswimfor2min.Forlearning,offspringwasgiventhreetrialsoneachdayfor4consecutivedays.Eachmousewasplacedatoneoftheotherthreestartingpointsthatwereusedinapseudo-randomordersothateachpositionwasusedonceineachblockoftet.Ifthemcedidnotfindteescapeplatformwithin60s,tereearcherguidedthemtotheplatformwheretheywereallowedtoremainfor15s.A1hintervalwasimposedbeforethebeginningofthenexttrial.TheplatformlocationwsntcduringteleperiTetimemcespentinfsubmgdplatform(EscapeLt)andswmspeedwerecord.Oneyafterthelearningperiod,aweresubmittedtoasingle60sprobetestinwhichtheplatformwasremovedfromthepool.Thedistancemiceswamaroundtheformerplatform(scoredefinedasthat,platformasorigin,12.5cminsemi-diameter),thetotaldistance,andthenumberofmicecrossingtheformerplatformpositionwereanalyzed.ThistestiscomonyknownastheMorriswrmaze,beauseRichardMorrisdevelopedthistesttomapspatialorientationinrats.Thetestconsistsofaroundwatertankorpool(132cmindiameter)withopaquewatercontainingatemperatureofabout2℃.Therathastoswimaroundthepooltosearchforaplatformofclearacrylicplasticontowhichhecanescapefromthewater.Inonecondition,theplatformisvisible,rising1cmabovethewrsurfce.nasd,emshnjutbelowthesuraeofthewae.Normalrascnleantofindthehiddenplatformprovideditremainsinafixedpositionrelativetodistalroomcues.Theratlearnstonavigatetotheappropriatepositioninspae.Temazeisdividedintofureqalquadrants(south–wet,north–wes,norh–east,south–east)andtheplatformishiddenhalfwaybetweentheside-wallsandthecenterofthepoolinoneofthequadrantsfollowingacounterbalancedparadigmwithingroups.Afteronetrialofhabition,eachratisgivenacertainnumberoftrialsadayoverseveraldaystolearntofindthehiddenescapeplatform.Theswimmingpatternisusuallyrecorded,andthelatencytoreachtheplatformismeasured.Eachtrialendswhentheratclimbsontotheplatformwhereitisallowedtostayforthe30sintertrialinterval.Inacuednavigationversionofthetest,thesidewalsareprovidedwithvisualcue.Thewtrmazeopensfortheuseofvariouscombinationsoftasksintermsofvisible(cue/nud)orhidenplatomindifeetseune.Theudvrionftisas,wihisqyl,iscpbeofreelgdfcsinsensory,motor,ormotivatinalprcess.Theplacelearningversionwithsubmergedplatformcnbeusedfrvariouslearningsets(e.g.,workingmemory)[1]宮的圖件面：○看時(shí)刻程度埋）程○前均度○次數(shù)○上臺(tái)情形的總結(jié)○四個(gè)象限逗留的時(shí)刻和路程刻路程圖4，實(shí)驗(yàn)步驟：4．1購(gòu)買小鼠。4行，在0。4．3迷宮。以小鼠上0。4．4據(jù)。4．5據(jù)。5，摸索問題：小鼠什么測(cè)3？？獻(xiàn)[]rndMhe，Nerornsitrsysemsivovedinlerigandmemoryinterat:ameaaalssbsdonstuisoffurbeairltak.BrinRserhRevews41(203)268–7料ThemazewaspatternedaftertheonedevelopedbyIwasaki(Iwasakietal.,1996).Itwasconstructedoforganicglassandthefloorpaintedblack.Thecentralarenawas25cminditerandeightas(32×10×9c)edradially.Foodcupswerelocatednearthedistalendofeacharm.Themazewaselevated30cmfromthegroundfloorandwaspositionedinatestingroomwithextra-mazeandinner-mazecues.Beforethebeginningoftheexperiment,animalswerefoodrestriction(50%foodofnormalneeds)for7daysuntiltheirbodyweightswerereducedto85%.Thisweightlevelwasmaintainedthroughouttheexperiment.Themiceweretestedfor9dsinsuccession.Asadaptation,mewereplacedindivuallyontheradialmefor5minon2consecutivedaysandallowedtoexplorewithfoodscatteredinallarms.Beforethesession,eachofthearmswasbaitedwith1/5to1/4ofapieceofstir-friedpeanut(cooledin–2℃beforeuse).Atthebeginning,themousewasplacedinanopaquebox(10×10×10cm)inthecentralplatform.After10s,theboxwasliftedandthemousewasallowedtofreelywalkthroughthemaze.Theperformanceofthemiceineachsessionwasassessedbythenumberoferrorchoices,whichwasdefinedasre-entryintoanalreadyvisitedarm.Observationwasdiscontinuedafter10mineveniftheanimalddnotfinishthetask.Testtookplacebeteen080and100housdaily.實(shí)驗(yàn)六成年小鼠學(xué)習(xí)經(jīng)歷行為檢測(cè)-穿梭箱AdultmicePerformanceinshuttlebox編寫張進(jìn)驗(yàn)的Obte）示（tokwtesrteofhteo,hwtosetocryutheuyofengadmmr,aan,o）驗(yàn)械材料aprtsandnmalnddu):梭（shtebx,），提，水。(utmleme,caedeatl)相軟件（s者ec）驗(yàn)容原理：1（thebkrud）ClsialcndtoingwasitoucdintotestdyofleanngatthetrnofthecetrybytheRusanpigtvnav.eenefcslcingiseagof2il.eoindsiulsCS,suhasaliht,tn,ortaciestmuus,schoenbeaseitprdueseihrnocovrtrsoseoraweakrepneusalyuneaedtoterepnsetateetalywilbelare.Therifocmet,oruncndtoedstmuu(U),suhasfoodorashcktothele,ischosnbecuseitnomalyprduesastrng,cositn,overtrsone,suhassaiatonorwitdrwalofthelg.Ucniiedrsossaina;teyaepruedwtotlann.WhnaCSisfloedbyaUS,teCSwillbgntoelctanewordifeetrepnecaldthecodtoedrepne.IfteUSisrwadng(oodorwae)tecodiinngistredappttv;iftheUSisnoiusaneetialshc),tecondtonngistemeddeenie2穿梭紹這種one-ralihbtryaoiace具,由McGaugh&d于1970，位置偏愛箱（穿梭箱）小為25X25c,8m中由夠滑金桿)；置一可活平（SeBo驗(yàn)（0.mA5H風(fēng)在運(yùn)）梭操軟件a)每前5秒對(duì)箱內(nèi)小鼠施加同側(cè)聲和異激)若5秒內(nèi)小鼠并未穿梭至對(duì)側(cè)，則在同側(cè)對(duì)一2V電刺刻10秒。Astagtaleywasdvddintotocopatens,nemaeofwhiePlxgl,25X25cm,hegt2c;andteotermdeofbakPlxga,The2cmprmnswaseupedwihareoabecvroftesmemaraltolowtecoprmnttoeindakes.hetocopamnsweeseaadbyasldngdor.Atenorlmp(60W,poiined80cmabvetheapaau)iluintdthewhtecmprmnt.hruhthemealforormealrd)oftedakcopatentsrmldcontntcretculdbedelvred(.1mA,50Hz1s).3ste-troghpasieavoianetask研關(guān)