酵母發(fā)酵力測(cè)定試驗(yàn)步驟

酵母發(fā)酵力的測(cè)定一、 目的通過(guò)測(cè)定酵母發(fā)酵力，篩選發(fā)酵力強(qiáng)的酵母。二、 實(shí)驗(yàn)原理酵母在微酸性糖液中起發(fā)酵作用，其中的糖逐漸減少，乙醇及CO2則依比例而增大，CO2是氣體，除溶解于醪中者外，都跑向外面，所以測(cè)定酵母的發(fā)酵力，或測(cè)糖液比重的減小，或測(cè)糖的減少，或乙醇的增加，或稱培器為減輕量，以CO2的失去多少，或用NaOH等固定CO2然后稱其量，或?qū)⑴囵B(yǎng)器密閉，由其中壓力的增大，而定發(fā)酵的強(qiáng)弱等。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇濃度增大、co2含量、糖的減少、培養(yǎng)器的減輕四個(gè)方面測(cè)定其發(fā)酵力強(qiáng)弱。三、 實(shí)驗(yàn)材料菌種：本公司實(shí)驗(yàn)室分離所得。試劑：葡萄糖、果糖、蔗糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蛋白胨、酵母浸膏、菲林試劑、碳酸氫鈉。器具：大三角瓶、小三角瓶、膠塞、玻璃管、1ml移液管、10ml移液管、天平、酒精計(jì)、溫度計(jì)、蒸餾器、培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基四、 方法步驟從斜面菌種接種到小三角瓶（100ml培養(yǎng)基）28°C培養(yǎng)24h；搖勻小三角瓶菌種，吸取10ml接種到大三角（1000ml），裝好CO2收集裝置，稱重，記錄其重量，置28C培養(yǎng)，每天稱重一次，直到重量減少量小于0.5g；發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)測(cè)量排水量測(cè)定CO含量；2取一定量的發(fā)酵醪液，測(cè)定其殘?zhí)橇浚詼y(cè)定其發(fā)酵力；取100ml發(fā)酵醪液，加100ml水蒸餾出100ml溶液，用酒精計(jì)測(cè)定其乙醇含量。（注：如果用酒精計(jì)不能測(cè)出，則改用重銘酸比色法或氣相色譜法）重銘酸比色法所需試劑如下：0.1%(v/v)標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液；(2)2%重銘酸鉀溶液；(3)濃硫酸；銘酸比色法酒精糟中微量乙醇的測(cè)定酒精糟中乙醇的含量是蒸餾時(shí)的一個(gè)重要指標(biāo)。但酒精糟中乙醇含量甚微，不宜采用酒精計(jì)測(cè)量，需用比色法測(cè)定，比色法測(cè)定乙醇其濃度下限可達(dá)0.02%。1、 原理酒精糟中殘余乙醇的測(cè)定采用蒸餾法，蒸出的乙醇用重鉻酸鉀氧化為乙酸，而六價(jià)鉻被還原為三價(jià)鉻，以比色法測(cè)定。3CHCHOH+2KCrO+8HSO=3CHCOOH+2Cr(SO)+2KSO+1乙 乙 / 乙 I 乙 I 乙 I1H2O2、 試劑0.1%(v/v)標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液(2)2%重鉻酸鉀溶液(3)濃硫酸3、 測(cè)定步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備在10毫升比色管中，按下列加入各溶液編號(hào)0123450.1%(v/v)標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液(毫升)012345水(毫升)543210各管中加1毫升重鉻酸鉀溶液，5毫升濃硫酸，搖勻。于沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。（2） 試樣管的制備稱取100克酒精，放入500毫升圓底燒瓶中，加200毫升水，蒸餾，用100毫升容量瓶正確接收餾出液100毫升，搖勻。取5毫升餾出液，放入10毫升比色管中，加1毫升2%重鉻酸鉀溶液，5毫升濃硫酸，搖勻，與標(biāo)準(zhǔn)系列管一起于沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。（3） 目視比色將試樣管與標(biāo)準(zhǔn)系列管比較色澤，求得酒精糟中乙醇含量：乙醇（毫升/100克）=Vx0.001x100/5式中V-試樣管與標(biāo)準(zhǔn)系列管色澤相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)管中標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液的體積（毫升）0.001-標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液的體積（毫升/毫升）5-所取餾出液的體積（毫升）100-餾出液的總體積（毫升）（4） 分光光度計(jì)法在600納米波長(zhǎng)下測(cè)光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試樣管光密度所對(duì)應(yīng)的0.1%的標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液的體積（V），按目視比色法測(cè)定。酵母菌常用培養(yǎng)基（1） 菌體生產(chǎn)培養(yǎng)基：葡萄糖150g，硫酸鎂0.1g，酵母膏15g,硫酸銨5g,磷酸二氫鉀8g,硫酸亞鐵0.1g，加水至1000ml，pH4.1?4.5；（2） 菌體補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖500g，硫酸鎂10g，酵母膏15g，硫酸銨30g，磷酸二氫鉀15g，硫酸亞鐵0.2g，加水至1000ml，pH4.1?4.5；（3） 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖600g，硫酸鎂4g，酵母膏6g，硫酸銨6g，磷酸二氫鉀2g，加水至1000ml，pH4.1?4.5；（4） YEPD培養(yǎng)基（用于酵母原生質(zhì)體融合）：酵母浸膏10g,蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL,pH6.0,115°C濕熱滅菌20min。（5） 芽汁瓊脂培麥養(yǎng)基成分：優(yōu)質(zhì)大麥或小麥，蒸餾水，碘液。制法：取優(yōu)質(zhì)大麥或小麥若干，浸泡6?12h，置于深約2cm的木盤(pán)上攤平，上蓋紗布，每日早、中、晚各淋水一次，麥根伸長(zhǎng)至麥粒兩倍時(shí)，停止發(fā)芽晾干或烘干。稱取300g麥芽磨碎，加1000mL水，38C保溫2h，再升溫至45C，30min，再提高到50C，30min，再升至60C，糖化1?1.5h。取糖化液少許，加碘液1?2滴，如不為藍(lán)色，說(shuō)明糖化完畢，用文火煮半小時(shí)，四層紗布過(guò)濾。如濾液不清，可用一個(gè)雞蛋清加水約20mL調(diào)勻，打至起沫，倒入糖化液中攪拌煮沸再過(guò)濾，即可得澄清麥芽汁。用波美計(jì)檢測(cè)糖化液濃度，加水稀釋至10倍，調(diào)pH5?6，用于酵母菌培養(yǎng)；稀釋至5?6倍，調(diào)pH7.2，可用于培養(yǎng)細(xì)菌，121°C滅菌20min。（6） 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）成分：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，瓊脂20g，水1000mL。制法：pH值自然。將馬鈴薯去皮、洗凈、切成小塊，稱取200g加入1000mL蒸餾水，煮沸20min，用紗布過(guò)濾，濾液補(bǔ)足水至1000mL，再加入糖和瓊脂，溶化后分裝，121C滅菌20min。另外，用少量乙醇溶解0.1g氯霉素，加入1000mL培養(yǎng)基中，分裝滅菌后可用于食品中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)、分離。（7） 米曲汁培養(yǎng)基制法：取150g大米于1000ml三角瓶中，用水洗三次，瀝干，加入水150g，常壓蒸熟，待米飯冷卻到28?35C時(shí)，接種適量（參考用量：一支斜面）糖化力強(qiáng)的根霉種，培養(yǎng)46?48h，接水（水溫70C以上）300ml，靜置4h以上，用紗布過(guò)濾，即制成米曲汁。根據(jù)培養(yǎng)條件，調(diào)節(jié)pH值及其他元素，即可。一般用于培養(yǎng)酵母和霉菌。（例如：培養(yǎng)霉菌及酵母，pH值一般調(diào)至4.5?5.0，同時(shí)需加入0.1%磷酸二氫鉀及0.05%的硫酸鎂）還原糖的測(cè)定：菲林試劑法原理：菲林試劑由甲液、乙液組成，甲液為硫酸銅溶液，乙液為酒石酸鉀鈉和氫氧化鈉溶液。兩液分別貯存，使用時(shí)等體積混合。甲液、乙液一經(jīng)混合，先生成氫氧化銅沉淀，進(jìn)一步與酒石酸鉀鈉反應(yīng)，是沉淀溶解生成酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物，絡(luò)合物中的二價(jià)銅是氧化劑，使還原糖中的的羰基氧化，自身則還原生成氧化銅沉淀，反應(yīng)終點(diǎn)用亞甲基藍(lán)指示劑顯示。亞甲基藍(lán)也是氧化劑，但其氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅反應(yīng)完畢，過(guò)量1滴還原糖，立即使亞甲基藍(lán)還原，藍(lán)色消失為終點(diǎn)。試劑配制：（1） 菲林試劑的配制：甲液：稱取硫酸銅（CuSO4?5H2O）69.3g溶于水并稀釋至1L。乙液：稱取酒石酸鉀鈉（C4O6H2KNa?4H2O）346g，氫氧化鈉（NaOH）100g，溶于水并稀釋至1L。（2） 2g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取于100?105C烘2h并在干燥器中冷卻的無(wú)水葡萄糖2g（準(zhǔn)確到0.0002g），溶于水，加5ml濃鹽酸（抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，可不加），用水定容至1L。（一般貯存在冰箱內(nèi)，不能存放太久，存放一周后需重配）（3） 10g/L亞甲基藍(lán)指示劑：1g亞甲基藍(lán)于100ml水中溫?zé)崛芙狻?.測(cè)定步驟（注意：菲林試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用?。?） 菲林試劑標(biāo)定：準(zhǔn)確吸取菲林甲液、乙液各5ml于250ml三角瓶中，加水約20ml，加入2滴亞甲基藍(lán)指示劑，用滴定管加入約24ml2g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，微沸2min后，繼續(xù)用2g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到藍(lán)色消失為終點(diǎn)。最后的滴定操作應(yīng)控制在1min完成。消耗糖液總量為V（ml）。即可求出10ml菲林試劑相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖的克數(shù)（F）。F=VXC（2） 糖液滴定：a，預(yù)滴定：準(zhǔn)確