一種快速檢測(cè)赭曲霉毒素a膠體金試紙條的研制

一種快速檢測(cè)赭曲霉毒素a膠體金試紙條的研制

褐球毒素是惡菌和綠霉屬產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物。它包含7種結(jié)構(gòu)類似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(OchratoxinA,簡(jiǎn)稱OTA)的毒性最強(qiáng)(大鼠經(jīng)口LD50為20mg/kg),WHO規(guī)定人的每天最大攝入量為16ngOTA/kg體重。OTA易蓄積于組織中,其作用的主要靶器官是腎臟、肝臟,屬烈性的腎臟毒和肝臟毒,實(shí)驗(yàn)表明動(dòng)物攝入被這種毒素污染的飼料后,就會(huì)發(fā)生急性或慢性中毒癥,此外,據(jù)文獻(xiàn)報(bào),導(dǎo)OTA還具有致癌、致畸和致突變性[2~4]。OTA的產(chǎn)毒菌株廣泛地存在于自然中,因此它極可能通過食物鏈進(jìn)入人體,從而對(duì)人體健康構(gòu)成潛在威脅。在目前條件下,要完全避免OTA對(duì)食品及飼料的污染非常困難。除了在糧食收獲、儲(chǔ)存、加工各個(gè)環(huán)節(jié)科學(xué)作業(yè)、注意防霉去毒外,唯一有效的辦法是加強(qiáng)對(duì)食品及飼料等的監(jiān)控檢測(cè),及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染的食品和飼料,并立即剔除,防止OTA超標(biāo)污染的食品進(jìn)入人類的食物鏈。自VANderMerve等1965年首次報(bào)道了OTA污染的各種飼料對(duì)雛鴨、大白鼠和小白鼠的毒性作用以來,世界各國(guó)有關(guān)學(xué)者對(duì)OTA進(jìn)行了許多的研究。人們相繼采用了薄層層析法(TLC)、高壓液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,簡(jiǎn)稱ELISA)和膠體金免疫層析等方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和分析。TLC是OTA早期研究中最常見的檢測(cè)方法,因其操作簡(jiǎn)便曾被廣泛應(yīng)用。但這種方法較費(fèi)時(shí)(48h左右),靈敏度和特異性較差,在OTA的提取過程中所需的有機(jī)溶劑品種多且量大。HPLC法具有更高的靈敏度,可以精確地對(duì)樣品中的OTA進(jìn)行定性和定量分析,世界各地已有不少文獻(xiàn)報(bào)道用高壓液相色譜法檢測(cè)真菌毒素,但此法不適合于大批量樣品的檢測(cè)。ELISA法由于其快速、靈敏、準(zhǔn)確、可定量、操作簡(jiǎn)便、無需貴重儀器設(shè)備,且對(duì)樣品純度要求不高,特別適用于大批量樣品的檢測(cè),但由于需要多種儀器設(shè)備,不適合于現(xiàn)場(chǎng)快速抽檢。膠體金免疫層析是出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初期的一種免疫分析方法。它是在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)以膜為固相載體的快速檢測(cè)技術(shù)。現(xiàn)在,國(guó)內(nèi)外銷售的金標(biāo)免疫快速檢測(cè)的成品多達(dá)幾十種,如在臨床檢驗(yàn)中的過敏癥標(biāo)志物、心臟病標(biāo)志物、藥物濫用、激素檢測(cè)、傳染性疾病的標(biāo)記物、免疫性疾病、腫瘤標(biāo)記物、毒物檢測(cè)、性傳播疾病和其他生化指標(biāo)的檢測(cè)(血紅蛋白、血脂等)。膠體金免疫層析法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、無需任何儀器設(shè)備、結(jié)果判斷直觀可靠、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn),容易被基層掌握并大面積推廣,適應(yīng)我國(guó)當(dāng)前社會(huì)經(jīng)濟(jì)技術(shù)水平,可以在食品安全領(lǐng)域發(fā)揮積極作用。本研究采用膠體金免疫層析法快速檢測(cè)赭曲霉毒素A,取得了較為滿意的結(jié)果。1材料和方法1.1材料和設(shè)備1.1.1化學(xué)試劑及試劑赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B、桔霉素標(biāo)品、氮羥基琥珀酸(NHS)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、氯金酸(HAuCl4·3H2O)美國(guó)Sigma公司;檸檬酸三鈉、碳酸鉀上?；瘜W(xué)試劑公司;NaN3湖州振興助劑廠;NC膜、吸水紙、樣品墊、膠金墊德國(guó)S&S公司。1.1.2紫外分光光度計(jì)XYZ3000平臺(tái)系統(tǒng)、試紙條切刀美國(guó)Biodot公司;Ultrospec4300紫外可見光分光光度計(jì)瑞典Pharmacia公司;H-600透射電鏡日本HITACHI公司;MA磁力攪拌加熱器德國(guó)Electromantle公司;飛鴿高速冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器總廠。1.2方法1.2.1ota-bsa的偶聯(lián)反應(yīng)本實(shí)驗(yàn)采用氮羥基琥珀酸法(NHS)制備OTA-BSA的偶聯(lián)物,其反應(yīng)分為兩步,第一步是OTA的活化,第二步是OTA與BSA的偶聯(lián)反應(yīng)。1.2.1.不同活化時(shí)間的ota、nhs、dcc的比例1mgOTA溶解于0.1ml無水THF,按OTA:NHS:DCC為1:2:4的比例,分別量取OTA、NHS、DCC,于室溫下、避光劇烈搖動(dòng),活化時(shí)間為60min?；罨箅x心15min(4000r/min),取上清,棄沉淀;揮發(fā)THF,殘留物溶于0.2ml二甲基甲酰胺。1.2.1.hahsco3中bsa的量將上述溶液滴加于5%的載體蛋白質(zhì)(BSA)溶液中(BSA溶于0.13mol/LNaHCO3中),BSA的量按OTA:BSA為20:1的比例量取。室溫、避光緩慢搖動(dòng),其偶聯(lián)時(shí)間為90min。反應(yīng)產(chǎn)物于0.05mol/L的NaHCO3透析72h,去除游離的OTA以及其它小分子,透析結(jié)束后樣品冷凍干燥即得OTA與BSA的偶聯(lián)物。1.2.2sp2/o小鼠骨髓細(xì)胞融合培養(yǎng)將合成好的OTA-BSA偶聯(lián)物免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾臟與SP2/O小鼠骨髓細(xì)胞融合,融合細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)7~14d,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選分泌抗體的雜交細(xì)胞株,雜交細(xì)胞株進(jìn)行三次克隆化,產(chǎn)生的克隆細(xì)胞株注入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水。1.2.3醋酸鈉東南角液溶膠液ph1.2.3.11.5ml腹水中加入3ml0.06mol/L醋酸鈉buffer(pH=4.7),靜置15min。1.2.3.216000r/min,4℃離心30min。1.2.3.3.3.制備中等層或優(yōu)定劑，ph調(diào)節(jié)至4.8，加入景山最終濃度為3.3%。室溫?cái)嚢?0分鐘1.2.3.416000r/min,4℃離心30min。1.2.3.將上述體積添加到1.10，并添加0.1mol和epbs1.2.3.6.將ph值調(diào)節(jié)到7.4，加入飽和硫酸銨0.232g/ml1.2.3.814000r/min,4℃離心15min。1.2.3.9沉淀為0.01mol/ml1.2.3.10sephonexg25鹽處理1.2.4cl4溶液的冷卻在一個(gè)1L的園底燒瓶中加入500ml0.01%HAuCl4溶液,加熱煮沸后立即加入1%檸檬酸三鈉溶液,溶液的顏色由淺黃→蘭色→深蘭→紅色,當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時(shí),繼續(xù)回流10min后停止加熱,冷卻至室溫。1.2.5橡膠黃金分析采用紫外可見光分光光度計(jì)和電鏡檢測(cè)膠體金。1.2.6單克隆抗體的制備調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8.2,用恒速攪拌器均勻攪拌,同時(shí)逐滴加入抗OTA的單克隆抗體,5min內(nèi)全部加完,繼續(xù)攪拌30min。取1/10體積的10%BSA溶液,連續(xù)加入膠體金溶液中,全部加完后,繼續(xù)攪拌15min。4℃,6000r/min離心40min。小心吸去上清,加入重懸液。1.2.7試紙條的制備用XYZ3000平臺(tái)系統(tǒng)在NC膜上噴檢測(cè)抗原(OTA-OV),在膠金墊上噴金標(biāo)抗體,將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸水紙依次組裝,用試紙條切刀切割成試紙條。1.2.8響應(yīng)面試驗(yàn)試紙條平放,將樣品加到試紙條的樣本墊上,10min看結(jié)果。如果檢測(cè)線上出現(xiàn)紅色條帶,說明樣品呈陰性,如果檢測(cè)線上沒出現(xiàn)紅色條帶,說明樣品呈陽性。1.2.9評(píng)估實(shí)驗(yàn)1.2.9.終濃度l用乙醇稀釋OTA標(biāo)準(zhǔn)品至1mg/ml,再用純水稀釋,使其終濃度為:5、10、15、20、30、40、50ng/ml。用試紙條檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)5次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷試紙條的檢測(cè)靈敏度。1.2.9.水稀釋的終濃度用乙醇稀釋OTA標(biāo)準(zhǔn)品至1mg/ml,再用純水稀釋,使其終濃度為:10、100、1000、10000、100000ng/ml。用試紙條檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)5次,判斷試紙條的檢測(cè)范圍。1.2.9.標(biāo)準(zhǔn)品終濃度的測(cè)定用乙醇稀釋赭曲霉毒素A的結(jié)構(gòu)類似物赭曲霉毒素B、桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品至1mg/ml,再用純水稀釋,使其終濃度為:1、5、10、50、100、500ng/ml。用試紙條檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)5次,判斷試紙條的檢測(cè)特異性。2結(jié)果與分析2.1吸收曲線和峰峰測(cè)定以雙蒸水作對(duì)照,用紫外可見光分光光度計(jì)在400~600nm進(jìn)行掃描,測(cè)定吸收曲線和吸收峰。膠體金結(jié)果為:λmax=519nm;OD519nm=0.976,見圖1。2.2磁體金透射電鏡掃描結(jié)果透射電鏡結(jié)果顯示所制備的膠體金粒徑均勻,隨機(jī)測(cè)量100個(gè)顆粒,膠體金粒徑在16±0.5nm,見圖2。2.3ph值經(jīng)pH試紙測(cè)定膠體金pH值為5.5。2.4快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限靈敏度及檢測(cè)范圍實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1所示。從表1結(jié)果中判定赭曲霉毒素A快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限為10ng/ml。0~100000ng/ml范圍內(nèi)有效。2.5似物與麻黃的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,赭曲霉毒素A的結(jié)構(gòu)類似物赭曲霉毒素B、桔霉素與赭曲霉毒素A快速檢測(cè)試紙條不產(chǎn)生交叉反應(yīng),赭曲霉毒素A快速檢測(cè)試紙條的特異性較好。3膠體金屬酶檢測(cè)試紙條的結(jié)果目前,國(guó)內(nèi)食品受生物毒素、農(nóng)藥、獸藥污染問題嚴(yán)重,國(guó)家和政府對(duì)此已做了大量的投入,但執(zhí)行情況仍不盡人意,造成該現(xiàn)象的主要原因之一是缺乏快速、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。膠體金免疫層析法是在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)速檢測(cè)技術(shù)。赭曲霉毒素A快速檢測(cè)試紙條利用的是抗原抗體特異性結(jié)合的原理。試紙條中含有底板和試劑吸附層。底板為不吸水薄片層,試劑吸附層固定在底板上,從加樣處開始分別為樣品墊、膠金墊、NC膜和吸水紙。在膠金墊上噴有金標(biāo)抗體,在NC膜上噴有偶聯(lián)了BSA的赭曲霉毒素A(檢測(cè)線)和驢抗鼠的二抗(控制線),在控制線出現(xiàn)紅線的前提下,根據(jù)檢測(cè)線是否出現(xiàn)紅色進(jìn)行判斷。樣本中的赭曲霉毒素A在流動(dòng)過程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合,抑制了抗體和NC膜檢測(cè)線上赭曲霉毒素A-OV偶聯(lián)物的結(jié)合。如果樣本中赭曲霉毒素A含量大于10ng/ml,檢測(cè)線不顯顏色,結(jié)果為陽性。反之,檢測(cè)線顯紅色,結(jié)果為陰性。如果控制線不出現(xiàn)紅色,則說明整個(gè)試紙條失效。具體如圖3所示。赭曲霉毒素A快速檢測(cè)試紙條應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的方法,整個(gè)過程只需一步加樣,10min內(nèi)就能判定結(jié)果,