親和層析技術(shù)在大分子分離中的應(yīng)用

親和層析技術(shù)在大分子分離中的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)出具有特定生物活性的細胞（微生物植物動物細胞）培養(yǎng)和大規(guī)模生物工程產(chǎn)品的分離和提取有非常嚴格的程序。特別是對于藥物蛋白質(zhì)，需要充分的生物活性，以滿足醫(yī)療應(yīng)用的特殊要求。由于生物高官自身的特殊性和復(fù)雜性，以及一些金融機構(gòu)對環(huán)境的ph值有很高的敏感性，因此需要對有機溶劑某些物理和化學(xué)性質(zhì)相似的生物活動進行有效分離和提取。只有根據(jù)不同的理學(xué)特性才能設(shè)計分離和提取的技術(shù)，以滿足生物技術(shù)的發(fā)展需要。在這種情況下，有必要從生物親和力的角度進行研究。親水技術(shù)是先進水平分析技術(shù)的最大優(yōu)點。在這種情況下，親水技術(shù)是生物材料中含量很低的材料，也可以分離出具有特定異質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的生化物質(zhì)。親水分析技術(shù)成功地分離了單克隆抗體人的異質(zhì)結(jié)生長因子細胞分裂素等藥物。因此，可以說，親水分析技術(shù)是目前分離精細生物物質(zhì)（如轉(zhuǎn)化藥物蛋白質(zhì)）等報道的最重要方法之一。1利用組織化學(xué)劑進行重復(fù)生物固相和生物作用的整合和親和層析分離技術(shù)親和層析是利用生物活性物質(zhì)之間的特異親和力使目標產(chǎn)物得以分離純化的液相層析法親和層析可應(yīng)用于任何兩種有特異性相互作用的生物大分子如酶與底物(包括酶的競爭性抑制劑和輔助因子)抗原與抗體激素與受體核酸中的互補鏈多糖與蛋白復(fù)合體等正是因為利用的是生物學(xué)特異性而不是依賴于物理化學(xué)性質(zhì)因而非常適合于分離低濃度的生物產(chǎn)品當(dāng)預(yù)分離的料液通過層析柱時樣品中對配基有親和力的物質(zhì)便借助靜電作用疏水作用金屬配位作用氫鍵作用和弱共價鍵作用以及結(jié)構(gòu)互補效應(yīng)等作用吸附到固相載體上根據(jù)配基與生物大分子作用體系不同可以把親和層析分為以下四種類型1.1知識產(chǎn)權(quán)酶抑制劑純化生物親和層析是利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質(zhì)對的親和層析通常具有很高的選擇性典型的物質(zhì)對有酶底物酶抑制劑激素受體等通常酶的底物并不是合適的親和配基因為它們易于轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物而影響目的產(chǎn)物的分離但是產(chǎn)物型化合物不會轉(zhuǎn)化成底物不存在這個問題盡管酶與產(chǎn)物的結(jié)合能力要弱于它與底物的結(jié)合能力但是在某些條件下產(chǎn)物型配基也能與酶強烈的相互作用因此利用酶產(chǎn)物型物質(zhì)對更加有利于酶的純化另外小分子量的競爭性抑制劑比蛋白抑制劑具有更多的優(yōu)點因為它們通常含有所需的多肽序列或其它生物識別結(jié)構(gòu)且不易生物降解楊青等以堿性磷酸酶抑制劑對氨基芐基磷酸為配基以瓊脂糖為載體分離純化從小牛腸中提取堿性磷酸酶(AKP)純化倍數(shù)達300倍活性回收率為90以上隋德新等以殼聚糖為載體雞蛋粘蛋白作配基對胰蛋白酶進行提純活性回收率達70純度經(jīng)SDSPAGE鑒定為一條譜帶但是所使用的配基是自然界中天然存在的價格較貴種類有限來源上有較大的局限性特別是對于一些匹配關(guān)系不清楚或根本不存在上述物質(zhì)對關(guān)系的蛋白就不能通過這種方法篩選配基進行分離純化1.2通過免疫親和層析純化蛋白質(zhì)免疫親和層析以抗原抗體中的一方作為配基親和吸附另一方的分離系統(tǒng)稱為免疫親和層析由于抗體與抗原作用具有高度的專一性并且它們的親和力極強(結(jié)合常數(shù)K在108109之間)所以許多典型的親和層析純化蛋白質(zhì)的過程已經(jīng)使用了單克隆抗體(簡稱單抗)作為親和配基目前利用抗體抗原模式有可能得到每一種目標蛋白的單抗然后以單抗為配基通過親和層析技術(shù)來分離純化目標蛋白質(zhì)鄧文濤等用純化的草魚生長激素(gcGH)單克隆抗體偶聯(lián)到CNBr活化的Sepharose4B凝膠上制成親和層析柱純化了重組鯉魚生長激素(rcGH)裴炎等利用麻蠅幼蟲血淋巴凝集素的抗體制備親和層析柱通過免疫親和層析一次性純化了麻蠅幼蟲血淋巴凝集素馮小黎等用合成的干擾素單克隆抗體高效液相親和介質(zhì)純化由大腸桿菌表達的基因重組人干擾素純化倍數(shù)為79倍活性回收率為941.3金屬離子親和層析分離超氧化物金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡(luò)合或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基如組氨酸的咪唑基半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合這也是IMAC用于蛋白質(zhì)分離純化的唯一依據(jù)金屬離子如鋅和銅已發(fā)現(xiàn)能很好的與組氨酸的咪唑基及半光氨酸的巰基結(jié)合含有不同數(shù)量這些基團的蛋白質(zhì)可以通過金屬離子親和層析得到分離它們具有以下優(yōu)點:(1)蛋白質(zhì)吸附容量大是天然配基結(jié)合量的10~100倍(2)價格便宜投資低(3)具有普遍適用性金屬離子配基具有很好的穩(wěn)定性吸附容量大成本很低且層析柱可長期連續(xù)使用易于再生譚天偉等以殼聚糖涂層固定化Cu2親和層析分離超氧化物歧化酶(SOD)純化倍數(shù)達20倍活性回收率為90Anshuman等利用固定化Cu2+親和層析分離大腸桿菌細胞抽提物通過不同的洗脫條件分別得到細胞色素C(Cytochromec)和溶菌酶(Lysozyme)金屬離子親和層析與免疫親和層析比較起來對蛋白質(zhì)的特異性差會發(fā)生非特異性吸附結(jié)合常數(shù)K在104~105之間為了增加結(jié)合的特異性可以通過基因工程人工合成多組氨酸殘基尾巴(PolyH尾巴)添加到蛋白質(zhì)的C末端這種基因工程蛋白與料液中的其它蛋白質(zhì)相比將會對金屬離子具有更高的特異性在分離純化后可再將尾巴剪切掉但是運用基因工程的手段便會產(chǎn)生與抗體配基同樣的問題另外螯合在親和載體上的金屬離子在操作過程中有可能脫落而混入產(chǎn)品中嚴重影響產(chǎn)品質(zhì)量1.4a.cibacron5g-100通過分子身份證的分離純化擬生物親和層析是利用部分分子相互作用模擬生物分子結(jié)構(gòu)或某特定部位以人工合成的配基為固定相吸附分離目的蛋白質(zhì)的親和層析尤以氨基酸(包括多肽)親和層析(AALA)和染料親和層析(DAFC)為代表染料配基能通過共價鍵牢固的結(jié)合到親和載體上由于價格低廉與蛋白質(zhì)的結(jié)合容量高并且不易為物理或化學(xué)物質(zhì)所降解因此也是一種較為理想的基團特異性配基廉德君等利用活性藍色染料柱(BlueSepharose)親和層析分離純化啤酒酵母脫氫酶組成型同工酶(ADHI),取得良好的效果趙翀等以F3GA(CibacronBlueF3GA)為配基與SephadexG-100交聯(lián)獲得親和吸附劑Bluedex用于免疫毒素(IT)的分離純化但是活性染料對蛋白質(zhì)分子特異性較低且染料配基通常是有毒性的且與蛋白質(zhì)會發(fā)生非特異性相互作用通過實驗找到一種與特定目的蛋白很好結(jié)合的染料配基是可能的但是產(chǎn)品回收純度不高特別是當(dāng)分離復(fù)雜的體系時難度更大多肽是親和層析純化生物大分子更有效的配基因為它只含有一些氨基酸所以即使脫落進入產(chǎn)物中也不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)多肽配基與抗體配基比較起來穩(wěn)定性更好它們能在GMP條件下進行大規(guī)模的無菌生產(chǎn)這樣可以大大降低成本與金屬和染料配基相比多肽具有更高的特異性且通常是無毒性的多肽由于與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似性它們之間的相互作用通常是溫和的因此在分離過程中可以采用溫和的洗脫條件避免了蛋白質(zhì)的變性失活金燦煌等以LysSepherose4B親和層析純化人纖溶酶原(Plg)純化倍數(shù)達350倍收率98Huang等人以EmphazeTMgel為載體六肽Try-Asn-PheGlu-Val-Leu為配基親和層析分離S蛋白取得了成功T.Makriyannis以三肽(ValAlaArg)為配基UltrgelA6Ragrosegel為載體分離純化胰蛋白酶(Trypsin)純化倍數(shù)為10倍收率90然而自然界中存在的與蛋白質(zhì)等生物大分子有天然親和性的多肽種類非常有限因此在研究多肽親和層析時一個重要的問題是確定多肽的結(jié)構(gòu)弄清楚產(chǎn)生特異性和親和性的機理肽與目標蛋白的結(jié)合最終是由于它們的表面互補性即電荷和疏水相互作用但是即使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)已知設(shè)計互補的氨基酸序列也是很困難的目前可用組合化學(xué)技術(shù)加以克服2接枝改性的生物分子與其它生化分離方法相比親和層析技術(shù)具有高收率高純度能保持生物大分子天然狀態(tài)等優(yōu)點廣泛的應(yīng)用于生物大分子的分離純化特別是對含量極少的基因工程產(chǎn)品的一步純化更顯示出這一技術(shù)的優(yōu)越性正是因為親和層析技術(shù)的高度特異性才能制備出高純度的生物大分子不僅用于大規(guī)模生產(chǎn)而且用于動力學(xué)研究和結(jié)構(gòu)測定(親和標記核磁共振X射線衍射等)此外親和層析與分子生物學(xué)相結(jié)合是一種很好的技術(shù)手段如Mason等利用該方法發(fā)現(xiàn)兩個大腸桿菌抗轉(zhuǎn)錄終止因子即NusB和核糖體蛋白S10能相互作用將S10偶聯(lián)到Affi-Gel載體上大腸桿菌粗提物通過層析柱用不同的條件洗脫收集洗脫蛋白進行SDS分析用抗NusB抗體進行Westernblotting進一步證實NusB能與S10相互作用但是親和層析技術(shù)也有一些缺點主要是載體(如瓊脂糖Sepharose)價格昂貴機械強度低(易壓床)配基的制備困難偶聯(lián)條件激烈需要使用劇毒的活化劑(如CNBr)等為了更好的克服這些缺點便形成了親和層析技術(shù)發(fā)展的兩大趨勢2.1聚苯乙烯-聚乙二醇pva珠和親和層析載體商品化的親和層析載體種類有限且價格昂貴遠不能滿足科研工作的需要在實際應(yīng)用中往往需要對載體進行修飾改性或自制新的載體使其更有利于親和吸附的進行以滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要據(jù)文獻報道在我國殼聚糖(Chitosan)被廣泛用于親和層析載體其特點是沒有非特異性吸附作用配基偶聯(lián)方法簡單此外DommimicC.N.等以聚苯乙烯二乙烯基苯(PSDVB)珠為載體用聚乙二醇(PVB)修飾其表面制成了新的親和層析載體這種載體具有良好的機械強度且PVA涂層消除了疏水相互作用避免了非特異性吸附的發(fā)生因此研制價格低廉機械強度高活化效率高的新型載體是親和層析的一大熱點2.2親和層析篩選及合成配基技