鐵皮石斛檢測規(guī)程

鐵皮石斛多糖與甘露糖檢測規(guī)程鐵皮石斛TiepishihuDENDROBIIOFFICMALISCAULIS本品為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimu-raetM1go的干燥莖。11月至翌年3月采收，除去雜質(zhì)，剪去部分須根，邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀，烘干；或切成段，干燥或低溫烘干，前者習(xí)稱“鐵皮楓斗”（耳環(huán)石斛）；后者習(xí)稱“鐵皮石斛”?！拘誀睢胯F皮楓斗本品呈螺旋形或彈簧狀.通常為2?6個旋紋，莖拉直后長3.5?8cm，直徑O.2?O.4cm。表面黃綠色或略帶金黃色，有細縱皺紋，節(jié)明顯，節(jié)上有時可見殘留的灰白色葉鞘；一端可見莖基部留下的短須根。質(zhì)堅實，易折斷，斷面平坦，灰白色至灰綠色，略角質(zhì)狀。氣微，味淡，嚼之有黏性。鐵皮石斛本品呈圓柱形的段，長短不等?！捐b別】（1）本品橫切面：表皮細胞1列，扁平，外壁及側(cè)壁稍增厚、微木化，外被黃色角質(zhì)層，有的外層可見無色的薄壁細胞組成的葉鞘層?；颈”诮M織細胞多角形，大小相似，其問散在多數(shù)維管束，略排成4?5圈，維管束外韌型，外圍排列有厚壁的纖維束，有的外側(cè)小型薄壁細胞中含有硅質(zhì)塊。含草酸鈣針晶束的黏液細胞多見于近表皮處。（2）取本品粉末1g，加甲醇50m1，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15ml使溶解，用石油醚（60?90°C）洗滌2次，每次20ml，棄去石油醚液，水液用乙酸乙酯洗滌2次，每次20ml，棄去洗液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取鐵皮石斛對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄WB）試驗，吸取上述兩種溶液各2?5〃l，分別點于同一聚酰胺薄膜上，使成條狀，以乙醇~丁酮-乙酰丙酮-水（15：15：5：85）為展開劑，展開，取出，烘干，噴以三氯化鋁試液，在105C烘約3分鐘，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點?！緳z查】甘露糖與葡萄糖峰面積比取葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含50ug的溶液，作為對照品溶液。精密吸取O.4m1，按［含量測定］甘露糖項下方法依法測定。供試品色譜中，甘露糖與葡萄糖的峰面積比應(yīng)為2.4?8.0。水分不得過12.O%（附錄IXH第一法）。取供試品2?5g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5mm；疏松供試品不超過10mm；精密稱定，打開瓶蓋在100?105C干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計算供試品中含水量（%）?？偦曳植坏眠^6.O%（附錄IXK）。測定用的供試品須粉碎，使能通過二號篩，混合均勻后，取供試品2?3g（如須測定酸不溶性灰分，可取供試品3?5g），置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量（準確至0.01g）,緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時，逐漸升高溫度至500?600°C，使完全灰化并至恒重。根據(jù)殘渣重量，計算供試品中總灰分的含量（%）。如供試品不易灰化，可將坩堝放冷，加熱水或10%硝酸鐵溶液2ml，使殘渣濕潤，然后置水浴上蒸干，殘渣照前法熾灼，至坩堝內(nèi)容物完全灰化?！窘鑫铩空沾既苄越鑫餃y定法（附錄XA）項下的熱浸法測定，用乙醇作溶劑，不得少于6.5%。按多糖取樣方法取供試品約4g（M），精密稱定，置250ml的錐形瓶中，精密加乙醇100ml，密塞，稱定重量，靜置1小時后，連接回流冷凝管，85C水浴加熱至沸騰，并保持微沸1小時。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25ml，置已干燥至恒重（M1）的蒸發(fā)皿（或50ml帶蓋坩堝）中（體積不可超過蒸發(fā)皿的一半，以防蒸的時候溢出），在水浴上蒸干后，于105C干燥3小時，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量（M2）。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。計算：浸出物％=（M2-M1）/M*100/25*100%【含量測定】（一）多糖1.1試劑6%苯酚：先配置80%苯酚：80g苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲存。再配置5%苯酚：取73ml80%苯酚于容量瓶中，加水至48g（每次測定均需現(xiàn)配），測定的時候就用5%的苯酚來測！1.1.2無水乙醇1.1.380%乙醇1.1.4濃硫酸1.2設(shè)備：10ml具塞試管，試驗前檢查塞子的密封性，不得有泄漏，10至15ml離心管，使管口離離心液液面1cm以上，以防離心液甩出。1.2.3紫外一可見分光光度計1.2.4冰箱與冰塊1.2.5粉碎機，耐酸薄手套。2.2對照品溶液的制備2.2.1）取無水葡萄糖對照品0.1g，精密稱定，加水制成每1m1含100Mg的溶液，即得。標準曲線的制備精密量取對照品溶液0ml、0.1ml、O.2ml、O.4ml、O.6m1、O.8ml，分別置10ml具塞試管中（用前注意檢查塞子的密封性），各加水補至1.0ml，精密加入5%苯酚溶液1ml（臨用配制），搖勻，再精密加硫酸5ml,搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰浴中冷卻5分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外一可見分光光度法（附錄VA），在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。20130723曲線y=0.0088x+0.1128,y為濃度.ug；x為吸光度。備注：1.檢測液位濃稠硫酸樣液，腐蝕性很強倒皿時一定小心不要弄到手上，最好帶上合適的手套。2.檢測液為濃稠硫酸樣液，且總體積只有7ml（共2皿），連續(xù)檢測多個樣品時，比色皿用水洗凈，盡量甩干，再用少量待測液潤洗，待測樣品放在冰水浴中，測一個拿一個。3.試劑添加順序：樣品-5%苯酚-濃硫酸，不可顛倒；樣品加濃硫酸前要搖勻，加之后也要搖勻，注意塞子密封，小心漏液。4,用過的濃硫酸中會有炭絲，若檢測液中黑炭絲的顏色有擴散的話，OD值會升高，需重處理復(fù)測。2.2.2供試品溶液的制備鮮莖100g以上，剪成2-3mm段，105°C鼓風(fēng)烘干，粉碎至過三號篩（50目），取本品共約O.3g，精密稱定，加水200ml，加熱回流2小時，放冷，轉(zhuǎn)移至250ml量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2mI，置15ml離心管中，精密加入無水乙醇10ml，搖勻，冷藏1小時，取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20分鐘，棄去上清液（必要時濾過，觀察上清液是否有沉淀，若有再離心或過濾），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8ml，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20分鐘，棄去上清液，沉淀加60-80度熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。測定法精密量取供試品溶液1m1，置10ml具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1ml”起，依法測定吸光度A，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計算，即得。多糖含量％=（A-0.1124）/0.0088*250*25/（2*m*1000000）*100其中（A-0.1124）/0.0088為檢測液濃度ug，250*25/（2*m）樣品稀釋倍數(shù)，1000000為單位換算系數(shù)1g=1000000ug。本品按干燥品計算，含鐵皮石斛多糖以無水葡萄糖（C6H12O6）計，不得少于25.O%。二）甘露糖照高效液相色譜法（附錄WB）測定。2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-O.02mol/L的乙酸銨溶液（19：81）為流動相；檢測波長為250nm。理論板數(shù)按甘露糖峰計算應(yīng)不低于。t000。2.2試劑2.2.1鹽酸氨基葡萄糖內(nèi)標溶液12mg/ml：300mg—25mlPMP（1-苯基-3-甲基-5-毗唑琳酮）甲醇溶液O.5mol/L：2.1775g-25ml氣溫低時稍稍加熱溶解鹽酸溶液O.3mol/L，3mol/L：3mol/L：25ml-100ml（校正到與3MNaOH濃度一致）氫氧化鈉溶液O.3mol/L，3mol/L：3mol/L12g-100ml2.3校正因子測定取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1ml含12mg的溶液，作為內(nèi)標溶液。另取甘露糖對照品約10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液1m1，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400p1，加O.5m01/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-毗唑琳酮）甲醇溶液與O.3mol/L的氫氧化鈉溶液各400p1，混勻，70°C水浴反應(yīng)100分鐘。再加O.3mol/L的鹽酸溶液500p1，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2ml（振搖1min），棄去三氯甲烷液（用潔凈干燥的2ml移液管吸取底部三氯甲烷），水層離心后，取上清液，0.45um針頭過濾器過濾，注入液相色譜儀，測定，計算校正因子fi。fi=f內(nèi)/f甘=A內(nèi)/C內(nèi)：A甘/C甘其中A甘與A內(nèi)分別為標樣中甘露糖和內(nèi)標的峰面積，C甘與C內(nèi)分別為檢測液中甘露糖和內(nèi)標的濃度mg/ml測定法取本品粉末（過三號篩50目）約O.12g，精密稱定，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4小時，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100ml（120ml），再精密加入內(nèi)標溶液2ml，煎煮1小時并時時攪拌，放冷，加水補至約100ml（完全轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶定容），混勻，離心，吸取上清液1*4ml，置12ml頂空瓶中，加3.Omol/L的鹽酸溶液O.5*4ml，封口，混勻，110C水解1小時，放冷，用3.Omol/L的氫氧化鈉溶液0.5*4ml調(diào)節(jié)pH值至中性（用pH試紙測定），吸取400pl，照校正因子測定方法，自“加O.5mol/L的PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液10p1，（最好經(jīng)過0.45um針頭過濾器）注入液相色譜儀，測定，即得。注意：轉(zhuǎn)移液體數(shù)量有限以上各移液管要干燥潔凈不要串用計算：甘露糖%=f