2019水質(zhì) 糞大腸菌群的測定 濾膜法

水質(zhì) 糞腸菌的測定 濾法目 次前 言 ii適用范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1方法原理 1干擾和消除 1試劑和材料 2儀器和設(shè)備 2樣品 3分析步驟 3結(jié)果計算與表示 5精密度和準(zhǔn)確度 6質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 6廢物處理 7注意事項 7附錄A（資料性附錄）糞大腸菌群檢驗記錄及報告格式 8i水質(zhì) 糞大腸菌群的測定 濾膜法適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中糞大腸菌群的濾膜法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測定。本方法的檢出限：當(dāng)接種量為100ml時，檢出限為10CFU/L；當(dāng)接種量為500ml時，檢出限為2CFU/L。規(guī)范性引用文件GB/T14581 水質(zhì) 湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ/T91 地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。糞大腸菌群 fecalcoliforms（heroolerantcoforms44.5℃培養(yǎng)24hC選擇性培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，并形成藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落的腸桿菌科細(xì)菌。菌落形成單位 colony-formingunits（CFU）單位體積樣品中的細(xì)菌群落總數(shù)。方法原理0.45μmMFC選24干擾和消除（8.1）1時加入硫代硫酸鈉溶液（6.6）消除干擾。重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集（8.1）時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.7）消除干擾。試劑和材料MFC培養(yǎng)基。胰胨蛋白胨氯化鈉10g5g3g5g乳糖12.5g膽鹽三號1.5g1%苯胺藍(lán)水溶液10ml1%玫瑰紅酸溶液（溶于8.0g/L氫氧化鈉液中）10ml將上述培養(yǎng)基中的成分（除苯胺藍(lán)和玫瑰紅酸外，溶解于1000ml水中，調(diào)節(jié)pH至115201%1ml1%玫瑰紅酸溶液（8.0g/L氫氧化鈉液中）1ml，混合均勻。如培養(yǎng)物中雜菌不多，則不加玫瑰紅酸亦1.2%～1.5%瓊脂可制成固體培養(yǎng)基。也可選用市售成品培養(yǎng)基。配5℃±3℃冰箱中保存，分裝到平皿中的培養(yǎng)基可2～4周。配制好的培養(yǎng)基不能進行多次融化操作，以少量勤配為宜。當(dāng)培養(yǎng)基顏色變化，或脫水明顯時應(yīng)廢棄不用。50mm0.45μm121℃203min/22～3次。12120min，備用。（NaS2O·5HO。（1H1NONa·2HO。硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10g/ml稱取15.7g硫代硫酸鈉（6.4），溶于適量水中，定容至100ml，臨用現(xiàn)配。乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15g/ml15g10030d。儀器和設(shè)備采樣瓶：1L、500ml250ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。2高壓蒸汽滅菌器：115℃、121℃可調(diào)。44.5℃±0.5℃。過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。pH0.1pH單位。90mm。一般實驗室常用儀器和設(shè)備。注：玻璃器皿及采樣器具試驗前要按無菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌20min備用。樣品樣品采集點位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。樣品采集量可根據(jù)水體實際情況而定，一般不少于250ml。10～15cm80%3～5min，3min70%～75%1min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內(nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點進行分層采樣時，應(yīng)自上而下進行，以免不同層次的攪擾。（.6（125ml0.1ml的硫代硫酸鈉溶液6.7125ml0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液。mg1.5mg樣品保存2h106h。實驗室接樣后，不能42h內(nèi)檢測。分析步驟樣品過濾根據(jù)樣品的種類判斷接種量，最小過濾體積為10ml，如接種量小于10ml時應(yīng)逐級稀釋。31/10和101:10稀釋的方法10ml90ml1:10稀釋樣品。樣品接種量參考表見表1。表1 接種量參考表樣品類型接種量（ml）1001010.110-210-310-410-5地表水水源水▲▲▲湖泊（水庫）▲▲▲河流▲▲▲廢水生活污水▲▲▲工業(yè)廢水處理前▲▲▲處理后▲▲▲地下水▲▲▲用滅菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜（6.2）貼放在已滅菌的過濾裝置（7.4）上，固定（6.3）沖洗器壁2～3s，關(guān)上開關(guān)。培養(yǎng)用滅菌鑷子夾取濾膜移放在MFC培養(yǎng)基（6.1）上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培培養(yǎng)24h±2h。對照試驗空白對照每次試驗都要用無菌水（6.3）按照步驟9.1和9.2進行實驗室空白測定。陽性及陰性對照將糞大腸菌群的陽性菌株（如大腸埃希氏菌Escherichiacoli）和陰性菌株（如產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter制成濃度為40～600CFU/L9.1～9.2步驟培養(yǎng)，4結(jié)果計算與表示結(jié)果判讀MFC培養(yǎng)基上呈藍(lán)色或藍(lán)綠色的菌落為糞大腸菌群菌落，予以計數(shù)。MFC培養(yǎng)基上呈灰色、淡黃色或無色的菌落為非糞大腸菌群菌落，不予計數(shù)。結(jié)果判讀參考圖片見圖1。陽性菌落 陰性菌（箭頭指示處）無菌落生長圖1 結(jié)果判讀參考圖片結(jié)果計算樣品中的糞大腸菌群數(shù)（CFU/L），按照公式（1）進行計算：CC11000f

（1）5式中：C——樣品中糞大腸菌群數(shù)，CFU/L；C1——1000——將過濾體積的單位由ml轉(zhuǎn)換為L；f——樣品接種量，ml；注：若平行樣結(jié)果都在20～60CFU/L范圍內(nèi)，最終結(jié)果取平均值以幾何平均計算。結(jié)果表示測定結(jié)果保留至整數(shù)位，最多保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測定結(jié)果≥100CFU/L時，以科學(xué)計數(shù)法表示。糞大腸菌群檢驗記錄及報告格式參見附錄A。精密度和準(zhǔn)確度精密度6個實驗室對低濃度（地下水，濃度均值為2.0×102CFU/L）、中濃度（地表水，濃度均值為1.6×105CFU/L）和高濃度（生活污水，濃度均值為1.6×107CFU/L）三個不同濃度糞大腸菌群的實際樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（3670MPN/L，可接受范圍為330～7710進行了65.3%～12%0.81%～2.1%0.51%～4.2%和6.8%3.9%4.0%和3.6%；實驗室間95%置信區(qū)間見表2。表2 實驗室間95置信區(qū)間低濃度（CFU/L）中濃度（CFU/L）高濃度（CFU/L）標(biāo)準(zhǔn)樣品（CFU/L）均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間2.0×1021.4×102～2.9×1021.6×1059.8×104～2.6×1051.6×1078.2×106～3.0×1076.1×1023.8×102～9.9×102準(zhǔn)確度6個實驗室對含糞大腸菌群濃度為3670MPN/L（可接受范圍為330～7710MPN/L）的標(biāo)準(zhǔn)樣品進行了6次重復(fù)測定：相對誤差范圍為-19%～-32%；相對誤差最終值為：-23%±10%。注：微生物檢測數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，其測定結(jié)果全部經(jīng)以10為底對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行計算。質(zhì)量保證和質(zhì)量控制培養(yǎng)基檢驗（如Escherichiacoli）和陰性菌株（Enterobacteraerogenes）配成適宜濃度，按樣品過濾（9.1）20～60個，然后按培養(yǎng)（9.2）6的要求進行操作，陽性菌株應(yīng)生長為藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落，陰性菌株應(yīng)生長為灰色、淡黃色、無色或無菌落生長。否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。對照試驗空白對照9.3.陽性及陰性對照定期按照9.3.2進行陽性及陰性對照試驗，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。廢物處理12130min或使用液體消毒劑（自制或市售）滅菌后，器皿方可清洗，廢物作為一般廢物處置。注意事項當(dāng)樣品渾濁度較高時，應(yīng)選用其他方法。7附錄A（資料性附錄）糞大腸菌群檢驗記錄及報告格式表A.1 糞大腸菌群測定檢驗記錄項目名稱： 檢驗日期： 年 月 日檢驗方法方法依據(jù)滅菌鍋型號出廠編號培養(yǎng)箱型號出廠編號培養(yǎng)基滅菌溫度（℃）