超聲輔助酶法制備燕麥ace抑制肽的研究

超聲輔助酶法制備燕麥ace抑制肽的研究

小麥?zhǔn)切←溂庸み^程中的輔助產(chǎn)品，含有大量的蛋白質(zhì)含量（15%30%）。結(jié)果表明，小麥蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)谷物蛋白，氨基酸比例合理。ACE抑制肽是一類對ACE有抑制作用的多肽,通過與ACE結(jié)合,阻止血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II,同時增加舒緩肽和腦啡肽的水平,從而達(dá)到降壓的作用。傳統(tǒng)ACE抑制肽的生產(chǎn)主要是采用蛋白酶水解的方法,但這種方法反應(yīng)速度較慢,而利用超聲波物理場破壞大分子物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)或改變分子空間構(gòu)型來改變生物活性,或者使生物大分子物質(zhì)易于降解,經(jīng)過超聲波處理后再利用酶解方法處理,不僅可以促進(jìn)酶解進(jìn)程,而且可以獲得高活性的酶解產(chǎn)物。本研究利用超聲輔助酶法制備燕麥ACE抑制肽,探討超聲波處理與酶解處理中的各種條件及各蛋白酶水解燕麥蛋白的最佳條件,以對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用為指標(biāo),利用響應(yīng)面法超聲波輔助酶法制備燕麥ACE抑制肽的最佳工藝。1材料和方法1.1zityes公司的紡粘設(shè)備燕麥麩皮河北省張家口農(nóng)科院燕麥研究所。Alcalase酶(食品級)Novozymes公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)(0.1U/mg)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(N-hippuryl-his-leuhydrate,HHL)Sigma公司。1.2水浴升溫振蕩江蘇khzJXD-02型超聲波電源(28、40、50、135kHz)北京金星超聲波設(shè)備技術(shù)有限公司;DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器江蘇太倉市實驗設(shè)備廠;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司。1.3方法1.3.1檢測方法1.3.1.肽鍵物質(zhì)的量采用OPA法測定。式中:h為水解后每克蛋白質(zhì)裂解的肽鍵物質(zhì)的量(mmol/g);htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵物質(zhì)的量(mmol/g),原料蛋白質(zhì)中肽鍵被裂解的百分?jǐn)?shù)表示蛋白質(zhì)被酶催化降解的程度。1.3.1.2.多酚含量采用Folin-酚法測定。1.3.1.ab對aa抑制肽的抑制率采用體外檢測方法。取5mmol/LHHL(hip-his-leu)溶液80μl(pH8.3,含0.3mol/LNaCl)與40μlACE抑制肽混合。37℃水浴預(yù)熱5min后,加入0.1U/mlACE溶液10μl,繼續(xù)37℃水浴30min。隨后加入1mol/LHCl溶液200μl終止反應(yīng)。再加入1.2ml乙酸乙酯均勻混合15s,以萃取反應(yīng)體系中的馬尿酸。1000×g離心10min后取出0.9ml酯層溶液轉(zhuǎn)入另一試管中,80℃烘干,并重新溶于3ml去離子水中,在228nm波長處測定吸光度。ACE抑制率如下式計算:式中:Aa為ACE及ACE抑制肽都存在條件下的吸光度;Ab為不存在ACE抑制肽條件下的吸光度;Ac為ACE不參與反應(yīng)條件下的吸光度。1.3.2超聲波輔助酶解燕麥阿斯匹林的影響將燕麥麩皮(20~60目過篩,粒徑在0.250~0.850mm范圍內(nèi))按一定料水比配制,分別利用超聲波輔助方法與傳統(tǒng)方法酶解方法比較,比較酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性和水解度,從而比較超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)酶法制備燕麥ACE抑制肽的優(yōu)勢。1.3.2.ph值對alcarlo-4和alcarase酶活性的影響稱取一定量燕麥麩皮按料水比為1:10(m/V)配制,放入塑料容器中,用1mol/LNaOH將燕麥麩皮液的pH值調(diào)至11,利用超聲波對燕麥麩皮液進(jìn)行預(yù)處理30min(超聲波水浴溫度55℃,超聲波頻率40kHz,超聲波功率154W),測定pH值(測定值為8.2,與Alcalase酶反應(yīng)的最適pH值基本一致),之后按酶與底物比為5%添加Alcalase酶,繼續(xù)在55℃水浴中反應(yīng)2h,隨后在85℃下滅酶10min。之后在12000r/min條件下離心5min,所得上清液(盡量除去離心液表面上的油脂)進(jìn)行抽濾,所得酶解液測定水解度,并對其進(jìn)行冷凍干燥,所得燕麥多肽粉末按蛋白濃度為8mg/ml配制溶液,進(jìn)一步測定其ACE抑制活性。1.3.2.燕麥麩皮液ph值對alcarlo為酶反應(yīng)的最適ph值的影響其他條件不變,預(yù)處理前不調(diào)pH值,當(dāng)用超聲波預(yù)處理后,用1mol/LNaOH將燕麥麩皮液的pH值調(diào)至8.5(Alcalase酶反應(yīng)的最適pH值),之后條件同1.3.2.1節(jié)。1.3.2.燕麥麩皮ph的預(yù)處理配制好的燕麥麩皮液放入塑料容器中,用1mol/LNaOH將燕麥麩皮液的pH值調(diào)至11,在55℃水浴下進(jìn)行預(yù)處理30min,之后條件同1.3.2.1節(jié)。1.3.2.超聲波輔助中燕麥麩皮液的制備配制好的燕麥麩皮液用1mol/LNaOH將燕麥麩皮液的pH值調(diào)至8.5(Alcalase酶反應(yīng)的最適pH值),之后按按酶與底物比為5%添加Alcalase酶,利用超聲波對燕麥麩皮液進(jìn)行處理2.5h(水浴溫度55℃,超聲波頻率40kHz,超聲波功率154W),之后條件同1.3.2.1節(jié)。1.3.3超聲波預(yù)處理及酶解過程中的影響將燕麥麩皮(20~60目過篩,粒徑為0.250~0.850mm)按一定料水比1:10配制,用1mol/LNaOH將燕麥麩皮液的pH值調(diào)至11,利用超聲波進(jìn)行預(yù)處理,隨后Alcalase酶在55℃(反應(yīng)最適溫度)進(jìn)行酶解,制備具有ACE抑制活性的燕麥多肽產(chǎn)物。在超聲波預(yù)處理過程中比較超聲波處理時間、超聲波頻率、超聲波功率及超聲波水浴溫度對多肽制備的影響,在酶解過程中比較酶解時間及加酶量對多肽制備的影響。實驗中利用產(chǎn)物對ACE抑制率及蛋白質(zhì)水解度作為指標(biāo)驗證制備效果。1.3.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理,以ACE抑制率為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面曲面分析進(jìn)行制備條件的優(yōu)化,并運用SAS8.0軟件分析得到最優(yōu)制備條件。2結(jié)果與分析2.1ce抑制肽和超聲波處理ce抑制劑從圖1可以看出,超聲波輔助酶法制備燕麥ACE抑制肽,在水解度和ACE抑制率上均高于傳統(tǒng)水浴酶解方法制備的燕麥ACE抑制肽,但是不能用超聲波直接處理酶解液,因為超聲波會使蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,使酶失活,因此其水解度和ACE抑制率值非常低;超聲波輔助酶法制備燕麥ACE抑制肽兩種方法比較可以看出,如果在超聲波預(yù)處理前,調(diào)節(jié)燕麥麩皮液pH值為堿性時,制備的燕麥多肽其ACE抑制率和水解度均高于不調(diào)節(jié)pH值的燕麥多肽,因此為后續(xù)實驗確定了實驗步驟。2.2超聲輔助酶法制備了燕尾醇單元素試驗2.2.1超聲時間對燕麥多肽水解度和優(yōu)化抑制率的影響如1.3.2.1節(jié)所示方法,其他條件不變,選擇超聲處理時間為0、10、20、30、40、50min和60min進(jìn)行比較,結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,隨著超聲時間的增加,燕麥多肽的水解度和ACE抑制率的變化并未呈現(xiàn)相關(guān)性。當(dāng)超聲時間為50min時水解度達(dá)到最高值16.53%,而其ACE抑制率并不高只有68.32%。而當(dāng)超聲時間30min,水解度只有14.73%,而ACE抑制率卻達(dá)到了80.45%,為實驗中最高。水解度值最高時,ACE抑制率并不是最高的。為了達(dá)到較高的ACE抑制率,實驗選取超聲處理時間為30min。2.2.2不同頻率對燕麥多肽水解的影響固定超聲波處理時間后,其他條件不變,選擇超聲波頻率為28、40、50、135、(28+40)kHz和(50+135)kHz6種頻率進(jìn)行比較,結(jié)果如圖3。從圖3可以看出,總體講,幾種超聲頻率處理后的燕麥多肽水解度相差不大,但是頻率的變化對ACE抑制率影響較大,當(dāng)頻率為50kHz時ACE抑制率達(dá)到84.48%,為最高值;而當(dāng)頻率為135kHz時ACE抑制率僅為69.93%。為了得到效果較好的ACE抑制肽,選擇超聲波頻率為50kHz。2.2.3個別值對阿斯匹林阿斯匹克單元溶液合成的影響固定超聲波功率后其他條件不變,研究超聲波功率44、88、132、176W和220W五個值對ACE抑制肽制備的影響,結(jié)果如圖4。從圖4可以看出,燕麥多肽的水解度值,先隨著功率的增加而上升,在功率為88W達(dá)到最大值17.11%,而多肽的ACE抑制率在當(dāng)功率為176W時達(dá)到最大值,抑制率為88.9%,因此選擇超聲波功率為176W進(jìn)行后續(xù)實驗。2.2.4溫度對水解度和阿斯匹林異性對實驗結(jié)果的影響固定超聲波功率后其他條件不變,選擇超聲波水浴溫度為45、50、55、60℃及65℃進(jìn)行研究,確定最佳溫度,實驗結(jié)果見圖5。從圖5可以看出,溫度的變化對水解度和ACE抑制率均有較大的影響,隨著溫度的變化,水解度和ACE抑制率的變化趨勢基本一致,隨著溫度的增加,兩者呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到55℃時,水解度和ACE抑制率均達(dá)到最大值,而在65℃時兩者均達(dá)到最小值。因此實驗選擇的超聲波水浴溫度為55℃。2.2.5酶解時間對水解度的影響固定超聲波水浴溫度后其他條件不變,選擇酶解時間為1、2、3h和4h進(jìn)行比較,實驗結(jié)果如圖6。從圖6可以看出,水解度隨著酶解時間的延長水解度先變大再減少,在3h時達(dá)到最大值,而當(dāng)時間為4h,水解度開始減少,可能是其中一些成分隨著時間延長發(fā)生了變化。ACE抑制率并未呈現(xiàn)此變化,ACE抑制率在2h達(dá)到最大值,出于ACE抑制率活性較好,且生產(chǎn)效率較高的原因,選擇酶解時間為2h。2.2.6不同酶解效果的確定固定超聲波水浴溫度后其他條件不變,研究加酶量,按酶與底物比為1%、3%、5%和7%進(jìn)行比較,得到較好的酶解效果,結(jié)果見圖7。從圖7可以看出,加酶量的增加對于水解度和ACE抑制率的影響較為明顯,隨著加酶量的增加水解度也不斷增加,當(dāng)加酶量到5%時增加趨勢變緩;ACE抑制率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在5%時達(dá)到最大值,由于其ACE抑制率較高,而且還能節(jié)約生產(chǎn)成本,因此選擇加酶量為5%。2.3應(yīng)用超聲波輔助酶法研究了燕尾醇的最佳制備工藝2.3.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用響應(yīng)面設(shè)計試驗,運用根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理,選擇對ACE抑制率有顯著影響的四個因素:超聲波處理時間(X1)、超聲波功率(X2)、超聲波水浴溫度(X3)和酶解時間(X4),進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析實驗,本研究以ACE抑制率為響應(yīng)變量,見表1。2.3.2響應(yīng)面方程的交互作用通過SAS8.0軟件進(jìn)行表2二次響應(yīng)面回歸分析,得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型:從表3方差分析可以得出ACE抑制率方程的一次項和二次項極其顯著,說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的一次線性關(guān)系。交互項極其顯著,因此說明各因素之間的交互作用很好,整個響應(yīng)面基于各因素間的交互作用構(gòu)成。另外,總回歸項極其顯著證明回歸方程擬合程度較好,說明實驗具有很高的可信性和準(zhǔn)確性;失擬項極其不顯著,因此說明實驗的誤差很小。2.3.3結(jié)果圖12做出響應(yīng)曲面,分析超聲波處理時間(X1)、超聲波功率(X2)、超聲波水浴溫度(X3)和酶解時間(X4)對ACE抑制率的影響情況,結(jié)果見圖8~13。通過SAS8.0軟件分析,由響應(yīng)曲面和等高線圖以及回歸方程分析可知,ACE抑制肽最佳制備條件為:超聲波處理時間28.40min、超聲波功率190.08W、超聲波水浴溫度55.05℃、酶解時間2.25h,按上述優(yōu)化條件做驗證實驗,制備燕麥ACE抑制肽測定ACE抑制率為87.50%(燕麥多肽干燥后粉末按多肽質(zhì)量濃度為8mg/ml配制水溶液后測定ACE抑制率)。3響應(yīng)面試驗結(jié)果3.1確定了超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)方法在提取ACE抑制肽的優(yōu)勢;經(jīng)過單因素試驗初步確定反應(yīng)了反應(yīng)條件超聲波處理時間30min、超聲波頻率50kHz、超聲波功率176W、超聲波水浴溫度55℃、酶解時間2h、加酶量5%。3.2利用響應(yīng)面設(shè)計實驗,運用根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理,選擇對ACE抑制率有顯著影響的四個因素:超聲波處理時間(X1)、超聲波功率(X2)、超聲波水浴溫度(X3)和酶解時間(X4),做四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。最終得到超聲波處理時間28.40m