健脾法對非特異性免疫相關的抗腫瘤作用機制研究

健脾法對非特異性免疫相關的抗腫瘤作用機制研究

癌癥是嚴重威脅人類生活健康的腫瘤之一，是腫瘤的第四種類型。在我國,中醫(yī)中藥被廣泛應用于胃癌治療中。近年來大量的臨床和實驗研究證實中醫(yī)健脾法在胃癌的治療中發(fā)揮重要作用,以健脾類藥物為基礎組成的復方治療可糾正胃癌患者脾虛狀態(tài),具有延長胃癌患者生存期,降低術后復發(fā)轉移等作用。實驗表明某些健脾類中藥復方不僅對裸小鼠NK細胞殺傷活性及紅細胞免疫功能有調節(jié)作用,對胃癌細胞生長還具有直接的抑制作用,其機制與下調Bcl-2、STAT3等基因的表達,抑制胃癌細胞增殖、誘導凋亡有關。由于臨床上用藥以辨證為原則,復方的組成常以健脾藥物為基礎結合清熱解毒、軟堅散結等其它類中藥,取得療效往往是整方作用的結果,對健脾藥物特有的作用機制了解并不全面。本研究將以往研究中證實對胃癌有效的以健脾為基礎的復方全方細化分為健脾組(由全方中的健脾類藥物組成)和非健脾組(由全方中非健脾類藥物組成),研究健脾類藥物對胃癌細胞生長的影響及對實驗動物非特異性免疫功能的具體作用和可能機制。中藥組成和分組中藥制備:全方由太子參12.0g,炒白術12.0g,茯苓12.0g,姜半夏9.0g,青皮4.5g,陳皮4.5g,生牡蠣30.0g,夏枯草9.0g,紅藤30.0g,菝葜30.0g,藤梨根30.0g等組成。健脾組由太子參12.0g,炒白術12.0g,茯苓12.0g,姜半夏9.0g,青皮4.5g,陳皮4.5g等組成。非健脾組由生牡蠣30.0g,夏枯草9.0g,紅藤30.0g,菝葜30.0g,藤梨根30.0g等組成。單味中藥由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房提供,均按以往方法煎制。各組中藥均調節(jié)濃度至120mg/mL(即每毫升含生藥量計),高溫高壓滅菌,備用。5-氟尿嘧啶(5-FU)(上海旭東海普藥業(yè)有限公司,批號:060501),乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(南京建成生物工程研究所第一分所)。2.動物分組、藥物代謝和血清ifn2.1瘤種人胃癌細胞MKN-45瘤種裸小鼠由上海腫瘤研究所饋贈,經體外、體內傳代,形成穩(wěn)定的皮下移植瘤模型,傳代至第8代(P8),進行第1次實驗后,繼續(xù)傳代,至第13代(P13),進行第2次實驗。2.2動物BALB/c-nu/nu裸小鼠6周齡,雄性,SPF級,體質量(20±2)g,抑瘤動物實驗重復2次。第1次共40只[動物合格證:SCXK(滬)2007-0005,No.0044099],第2次共78只[動物合格證:SCXK(滬)2007-0005,No.0049570]。2.3造模及分組皮下移植瘤模型造模采用文獻和以往的方法——組織塊套管針法。造模7d后選瘤塊5mm3以上的動物進行隨機分組進入實驗,隨機分為全方組、健脾組、非健脾組、5-FU組、生理鹽水組及非造模組(第2次實驗),具體動物數(shù)見表。治療組分別予相應藥物0.5mL/d灌胃,1次/d;5-FU組50mg·kg-1·d-1腹腔注射,1次/周,共4周;生理鹽水組:0.9%氯化鈉溶液0.5mL/d灌胃,1次/d;非造模組予常規(guī)飼養(yǎng)。實驗第31天,處死實驗動物。無菌剝離瘤塊,稱取瘤塊重量;無菌保存瘤塊標本分別液氮凍存和常規(guī)石蠟包埋;摘眼球取血,提取血清。2.4抑瘤率計算方法腫瘤抑制率按以下公式計算:抑瘤率(%)=(生理鹽水組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重×100%。2.5自然殺傷細胞(naturalkillercell,NK)細胞活性采用LDH釋放法。具體操作按試劑盒說明書進行。2.6血清IFN-γ含量采用酶聯(lián)免疫吸附反應(ELISA)方法檢測血清IFN-γ含量。使用R&D公司小鼠IFN-γElisa試劑盒,具體操作按試劑盒說明書進行。DENLEYDRAGONWellscanMK3酶標儀檢測。2.7脾細胞活化性受體(nature-killergroup2menberD,NKG2D)表達提取小鼠脾細胞,裂解液反應后離心,BCA法測定蛋白濃度;WesternBlot檢測脾細胞NKG2D受體表達。采用半干轉膜方式。一抗為RatIgG2BantimouseNKG2D,稀釋1:1000。Quantityone軟件進行灰度分析比較。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據用表示,方差齊性檢驗后,采用單因素方差分析對實驗結果進行統(tǒng)計學分析,均數(shù)間多重比較采用最小顯著差法(LSD檢驗),顯著性水準為α=0.05。各組小鼠血清nk細胞殺活性、血清ifn-、非健脾的檢測比較兩次實驗中,全方組、健脾組、非健脾組和5-FU組平均瘤重均低于生理鹽水組(P<0.01);實驗一抑瘤率分別為34.40%、30.69%、26.98%、36.33%;實驗二抑瘤率分別為23.68%、28.32%、38.28%、38.87%。健脾組平均瘤重與全方組相比差異無統(tǒng)計學意義,非健脾組與全方組相比差異亦無統(tǒng)計學意義,健脾組與非健脾組相比差異無統(tǒng)計學意義,全方組、健脾組、非健脾組和5-FU組相比,差異無統(tǒng)計學意義。生理鹽水組的NK細胞殺傷活性較非造模組降低(P<0.01);全方組、健脾組、非健脾組均高于生理鹽水組(P<0.01),5-FU組與生理鹽水組相比,差異無統(tǒng)計學意義;全方組、健脾組、非健脾組及5-FU組均低于非造模組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);健脾組與全方組相比,差異無統(tǒng)計學意義,非健脾組和5-FU組均低于全方組,差異有統(tǒng)計生理鹽水組血清IFN-γ含量較非造模組降低(P<0.01);全方組、健脾組、非健脾組均高于生理鹽水組(P<0.01),5-FU組與生理鹽水組相比,差異無統(tǒng)計學意義;全方組、健脾組與非造模組相比,差異無統(tǒng)計學意義,非健脾組和5-FU組均低于非造模組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);健脾組與全方組相比,差異無統(tǒng)計學意義,非健脾組和5-FU組均低于全方組(P<0.01)。生理鹽水組NKG2D受體表達量較非造模組降低(P<0.01);全方組、健脾組、非健脾組均高于生理鹽水組(P<0.01),5-FU組與生理鹽水組對照相比,差異無統(tǒng)計學意義;全方組、健脾組及非健脾組與非造模組相比,差異無統(tǒng)計學意義;5-FU組低于非造模對照組(P<0.01);健脾組與全方組相比,差異無統(tǒng)計學意義,非健脾組與全方組相比,差異無統(tǒng)計學意義,5-FU組低于全方組(P<0.01)。增強nk細胞殺傷活性本研究結果發(fā)現(xiàn),健脾為主的全方組及其中的健脾組和非健脾組的兩次實驗統(tǒng)計的瘤重均明顯低于生理鹽水組,差異具有顯著性(P<0.01),提示以健脾為基礎的復方全方及方中的健脾和非健脾組分均能抑制裸小鼠皮下移植瘤腫瘤生長,與以往的研究結果一致。對各實驗和對照組皮下移植瘤裸小鼠脾NK細胞殺傷活性的測定結果顯示,生理鹽水組NK細胞殺傷活性明顯低于非造模組,處于免疫抑制狀態(tài),提示造模后移植腫瘤對裸小鼠的免疫功能有明顯的抑制作用;而全方組及健脾組均可上調造模裸小鼠的NK細胞殺傷活性,使之接近于非造模組的水平,表明實驗中的全方組和健脾組藥物可通過上調造模動物低下的NK細胞活性,提高荷瘤機體的非特異性免疫。相比較而言,非健脾組雖然也顯示了上調荷瘤機體的NK細胞殺傷活性,但效果明顯低于全方組和健脾組,提示健脾類中藥在全方中起到上調NK細胞活性的主導作用。5-FU組的裸小鼠脾細胞中NK細胞殺傷活性較非造模組下降,與生理鹽水組比較無統(tǒng)計學差異,提示化療藥物5-FU無明顯調節(jié)NK細胞殺傷功能的作用。非特異性免疫是機體免疫的第一道防線,是生物體固有的、對高危致病因子即時反應的“非特異性”抵御外來侵襲的第一道防線。非特異性免疫功能的高低,決定了免疫系統(tǒng)對腫瘤發(fā)揮殺傷功能的水平高低,直接體現(xiàn)著機體免疫系統(tǒng)的免疫反應性,也是諸多學者討論腫瘤免疫功能變化的重要指標。TAdachi等發(fā)現(xiàn),抑制機體內N-乙酰半乳糖氨基轉移酶可以上調胃癌患者體內NK細胞對腫瘤的免疫反應性,提高患者的腫瘤免疫功能。已有報道發(fā)現(xiàn)健脾扶正類藥物能提高正常小鼠以及免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能,本研究結果也證實了這一點。在機體中,應激活化的NK細胞可以產生IFN-γ,這類細胞因子具有很強的免疫調節(jié)作用,可以對NK細胞具有反饋性的激活作用,增強NK細胞的活化,從而增強NK細胞對靶細胞的殺傷作用。IFN-γ被認為是NK細胞天然誘導劑,可促進NK細胞的生長和分化,增強NK細胞的細胞毒活性,抗原依賴的細胞介導細胞溶解作用(ADCC)和NK細胞毒因子的釋放。本研究中筆者進一步測定了各實驗組和非造模對照組荷瘤鼠血清中IFN-γ含量,結果表明生理鹽水組荷瘤鼠血清IFN-γ含量明顯低于非造模組,提示移植瘤可下調模型動物血清IFN-γ含量;而全方組及健脾藥物組IFN-γ含量高于生理鹽水組,表明全方和健脾藥物均可以上調荷瘤小鼠血清中下降的IFN-γ含量使之接近于非造模組的正常水平,從而發(fā)揮免疫協(xié)同作用以增強NK細胞殺傷活性;非健脾組雖然同樣顯示了上調荷瘤機體血清中的IFN-γ含量,但仍明顯低于非造模組以及全方組和健脾組,進一步提示健脾藥物在調節(jié)荷瘤小鼠IFN-γ中起主要的作用。而5-FU組IFN-γ含量與生理鹽水組無統(tǒng)計學差異;同時明顯低于非造模組和各中藥實驗組,表明化療藥物5-FU對模型動物IFN-γ無明顯影響作用。NKG2D是NK細胞表面的C型凝集素活化性受體,NKG2D與腫瘤細胞表面配體結合,殺傷腫瘤細胞。NKG2D廣泛地表達于多種免疫細胞,在鼠類所有NK細胞、部分NKT細胞、部分脾CDT輔助淋巴細胞、巨噬細胞都表達NKG2D。在人類中除表達于所有NK細胞外,NKG2D在未受刺激的外周血細胞、CDT輔助淋巴細胞及腸上皮內CDT輔助淋巴細胞上都有表達。NKG2D可作為協(xié)同刺激分子增強或協(xié)同其他活化性受體激活抗原特異性細胞的抗腫瘤免疫作用。NKG2D是迄今為止被鑒定出相應配體的一類非常重要的非MHC型活化性受體。在NK細胞發(fā)揮非特異性免疫功能的過程中,NKG2D的表達與相繼誘導免疫細胞分泌IFN-γ的作用被認為在其中發(fā)揮了重要的免疫協(xié)同作用。IFN-γ可以繼續(xù)誘導NK細胞殺傷靶細胞,發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。本研究結果顯示生理鹽水組裸小鼠脾細胞NKG2D蛋白表達明顯低于非造模組,處于免疫抑制狀態(tài);全方組、健脾藥物組和非健脾藥物組均可以上調NKG2D表達水平至接近于非造模組的正常水平。而5-FU組的裸小鼠脾細胞NKG2D受體表達水平則與生理鹽水組無統(tǒng)計學差異,提示化療藥物5-FU無明顯調節(jié)NKG2D受體表達作用。結合上述血清IFN-γ含量測定和NK細胞殺傷活性測定的結果,表明全方組、健脾藥物組可上調宿主脾細胞NKG2D受體表達,并相繼性地誘導免疫細胞分泌IFN-γ,免疫協(xié)同性地刺激NK細胞發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用,而非健脾藥物組分雖可上調宿主脾細胞NKG2D受體表達,部分誘導免疫細胞分泌IFN-γ,并部分上調宿主的NK細胞殺傷活性,但其誘導免疫細胞分泌IFN-γ和上調宿主的NK細胞殺傷活性的作用均明顯低于全方組和健脾組,提示健脾藥物組分在上調荷瘤鼠的非特異性免疫中發(fā)揮了主導作用。本研究