不同中醫(yī)治法對原發(fā)性肝癌大鼠肝組織中ras基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

不同中醫(yī)治法對原發(fā)性肝癌大鼠肝組織中ras基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

核電站癌（pmi）是中國最常見的腫瘤之一，死亡率很高，現(xiàn)在是腫瘤死亡率的第二天。我們課題組通過對近20年大量的有關(guān)中醫(yī)藥治療肝癌的文獻調(diào)研,發(fā)現(xiàn)清熱解毒、活血化瘀、健脾理氣,以及此三法的綜合療法最為常見,并且我們已多次實驗,一再證實這四種不同治法均能夠不同程度地提高肝癌大鼠的生存率,降低大鼠肝癌組織中N-ras癌基因的轉(zhuǎn)錄水平。本文報道了我們在以往研究的基礎(chǔ)上,進一步觀察這些不同中醫(yī)治法方藥對Ras家族中另兩個基因H-ras及K-ras轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用,探討比較這些不同治法的作用機理,給臨床辨證治療提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1動物和小組雄性Wistar大鼠,體重100~120克,清潔級,總共77只。共分7組,每組動物11只。1.2大肝模型除正常組以外的實驗大鼠均自由飲用60~80ppmDEN水溶液,至實驗?zāi)Ｐ椭苽浣Y(jié)束共20周。1.3藥物的制備和給藥方法1.3.1養(yǎng)藥方使用不同清熱組用清熱解毒法,用由半枝蓮、白花蛇舌草、蒲公英3味組成的清熱方;活血組用活血化瘀法,用由丹參、桃仁等4味藥組成的活血方;健脾組用健脾理氣法,用由黃芪、白術(shù)等4味藥組成的健脾方;抑癌組是以上三方的合方;西藥組用喃氟啶(FT-207);模型組不用藥。1.3.2藥物處理和飲食治療中藥購自上海市徐匯區(qū)中藥飲片廠。各組中藥分別經(jīng)煎煮、取汁、過濾、醇沉、蒸餾提取至1毫升含2克生藥,4.0℃保存?zhèn)溆谩Ｎ魉帉φ战M用喃氟啶片。待造模結(jié)束進行治療時,各組備用藥物加蒸餾水溶解稀釋,加入大鼠飲水瓶中自由飲用,劑量為成人單位公斤體重的10倍。各治療組從20周造模實驗結(jié)束后開始給藥,連續(xù)4周至實驗結(jié)束。1.4土壤研究二乙基亞硝胺(Diethvlnitrosamine,DEN):購自中國科學(xué)院南京土壤研究所。逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV200U/ul)、TaqDNA聚合酶(5U/μl)、DNAMarker(each100bp):購自華美生物工程公司。1.5主要設(shè)備PCR基因擴增儀(PE公司9600型)、計算機圖象分析系統(tǒng)(ZEISS公司KS400型)1.6ras和avp基因的rt-pcr檢測1.6.1肝組織rna的提取動物處死后,無菌情況下取出大鼠肝臟,稱重,統(tǒng)一于右肝內(nèi)緣切下一塊大約0.1g的肝組織,按異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法,抽提肝組織總RNA。1.6.2基于tin的生物計算AFP、三個Ras基因及大鼠參照基因β-actin的cDNA檢索自GenBank,由引物設(shè)計軟件設(shè)計引物序列,最后由上海生工生物工程公司合成。這些引物的上、下游序列參見表1:1.6.3pcr擴增dntp基因每組的每一個樣本取總RNA5μl,加雙蒸水1ml,分別于分光光度計260nm和280nm處讀取OD值,OD260/OD280在1.8以上者方可使用。總RNA濃度=OD260×8(μg/μl),用前調(diào)整濃度至1μg/μl,再每組各樣品取5μg混合,作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RT反應(yīng)體系(20μl)中含:dNTP(each10mM)2μl,5*buffer4μl,DTT(100mM)1μl,RNAsin(40U/μl)1μl,隨機引物(100μM)1μl,組織總RNA2μg,加水至18μl;65℃5min,冰上加入RNAsin、M-MuLv各1μl,37℃60min,最后94℃5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。-20℃保存。PCR總反應(yīng)體積為40μl,每個待測基因的每個組別設(shè)2個復(fù)管,將雙蒸水24μl、4μM待測基因的上下游引物各1μl、dNTP(0.5mM)2μl、10×Buffer4μl、MgCl2(25mM)4μl、RT產(chǎn)物4μl、TapDNA聚合酶0.4μl混合于0.5mlPCR薄壁管中,再加入石蠟油25μl,然后放入PCR儀中,選定94℃40s、55℃1min、72℃2min反應(yīng)程序,共30個循環(huán)。最后對PCR結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果在紫外線透視反射分析儀上觀察,并拍照,然后經(jīng)計算機圖象分析系統(tǒng)測算電泳條帶的光密度值。1.6.4基于轉(zhuǎn)錄特征的目的基因相對轉(zhuǎn)錄量的分析取電泳凝膠的底片,用KS400型圖象分析系統(tǒng)進行光密度掃描,以目的基因光密度值與對應(yīng)樣品內(nèi)參基因β-actin光密度值的比值作為該樣品中目的基因的相對轉(zhuǎn)錄量。最后以目的基因的相對轉(zhuǎn)錄量為參數(shù)進行分析。由于組內(nèi)最少樣本數(shù)為3個,因此每個目的基因的相對轉(zhuǎn)錄量只相當(dāng)其均數(shù),反映其趨勢,不作統(tǒng)計。2結(jié)果2.1不同中醫(yī)治療組對大鼠肺癌細胞轉(zhuǎn)錄水平的影響表2中,正常組AFP基因相對轉(zhuǎn)錄量很低,而模型組、西藥組明顯升高,各不同中醫(yī)治療組均能不同程度地抑制該基因在大鼠肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平。2.2對ras基因突變轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用表3中,各造模組大鼠H-ras、N-ras及K-ras癌基因的轉(zhuǎn)錄量與正常組大鼠相比,均有明顯升高;與模型組相比,各治療組對3個Ras基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下調(diào)作用。其中,健脾組對H-ras癌基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)較為明顯;清熱組、活血組對N-ras癌基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)更為明顯,其中活血組下調(diào)的結(jié)果幾乎與正常組一樣,健脾組對它也有一定的下調(diào)作用;治療各組對K-ras癌基因的轉(zhuǎn)錄水平均有一定的下調(diào)作用,其中以健脾組作用最好。3ras基因在肺癌細胞保護和基因表達中的作用研究表明,原發(fā)性肝癌的發(fā)生是原癌基因的激活和抑癌基因失活的結(jié)果,這必然會導(dǎo)致其編碼的蛋白發(fā)生質(zhì)和量的改變,從而引起細胞惡變。Ras癌基因是人們較早發(fā)現(xiàn)的存在于原發(fā)性肝癌中的一種癌基因,美國Barbacid研究小組最早從事肝癌癌基因的研究,并很早就證明了ras基因的存在。國內(nèi)學(xué)者顧健人首次提出了肝癌癌基因譜這個概念,并對該基因譜做了較系統(tǒng)的研究。國內(nèi)外的大量研究都證明:在原發(fā)性肝癌中,Ras癌基因在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均有明顯升高。因此,研究Ras癌基因能夠很好地幫助我們深入探討原發(fā)性肝癌的發(fā)病機理和治療途徑。癌基因Ras最初是從鼠肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的,它包括H-ras、K-ras和N-ras。研究發(fā)現(xiàn),它是廣泛存在于生物體內(nèi)的高度保守的、調(diào)控正常細胞生長和分化的重要基因。Ras基因編碼一個分子量為21KDa的小蛋白,Rasp21蛋白能與GTP或GDP結(jié)合,是鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白,具有GTP酶活性,具有兩種不同的構(gòu)象,即GTP結(jié)合和GDP結(jié)合兩種形式。它位于細胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)面,胞外的多種刺激信號都可以激活Ras,激活的Ras就與其效應(yīng)蛋白相互作用,并主要通過ras/MAPK信號通路向細胞內(nèi)傳遞信號,故又叫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,起著分子開關(guān)的作用。研究表明,ras/MAPK信號傳導(dǎo)通路是細胞外刺激信號傳遞到細胞核內(nèi)最基本最重要的途徑。基于此,Rasp21蛋白在各種細胞的代謝調(diào)節(jié)過程中特別是在腫瘤的發(fā)生中起著十分關(guān)鍵的作用。研究證明,Ras基因是原發(fā)性肝癌的重要癌基因,在肝癌基因譜中占據(jù)十分重要的位置。它在肝癌組織或?qū)嶒炐愿伟┘毎抵芯?jīng)常處于高表達狀態(tài)。近年來,較多實驗資料表明,H-ras、N-ras等癌基因在自發(fā)性或化學(xué)誘發(fā)的肝癌過程中常呈激活或有異常表達,這就提示它們在肝癌的發(fā)生過程中可能起著重要作用。本實驗結(jié)果表明,模型組大鼠H-ras、N-ras及K-ras癌基因的轉(zhuǎn)錄量與正常組大鼠相比,均有明顯升高,各治療組ras基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下調(diào)作用,這也與以前的實驗結(jié)果相一致。但各種不同治法組對3個Ras基因的影響各不相同,表明它們對不同的基因有不同的針對性調(diào)節(jié)作用,影響最大的靶點互不相同。其中,健脾理氣法對K-ras、H-ras作用最強,而這兩個癌基因的高表達和腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。因此,該法能有效地抗腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移,這也進一步闡明該法多用于臨床患者手術(shù)或放化療后鞏固治療的原因。而清熱解毒法與活血化瘀法對N-ras的作用較強,而N-ras癌基因與腫瘤的增殖有關(guān),甚至有人認(rèn)為在肝癌的治療中只要能抑制該基因的表達便能抑制腫瘤的生長,因此,該兩種治法有較強的抑瘤作用。目前,癌基因Ras已經(jīng)成了現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)腫瘤靶向性治療的重要目標(biāo),是設(shè)計抗癌新藥的