十字花科植物不同器官的過(guò)氧化物酶、-淀粉酶和苯丙氨酸解氨酶活性分析

十字花科植物不同器官的過(guò)氧化物酶、-淀粉酶和苯丙氨酸解氨酶活性分析

花卉科的許多植物具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，通常用作食物和藥物。研究顯示,有些十字花科植物具有顯著的抗癌作用。過(guò)氧化物酶[peroxidase,POD,EC1.11.1.7],能有效地清除生物體內(nèi)的過(guò)氧化物,是生物抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的主要成分之一;苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5)是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶,藥用十字花科植物的許多藥用成分都由苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)生;POD是一種多底物的酶,除過(guò)氧化氫作為其必須底物外,苯丙烷類代謝途徑所產(chǎn)生的許多產(chǎn)物也是POD的底物,POD,PAL在植物次生代謝中起重要作用。α-淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase,EC3.2.1.1)所產(chǎn)生的葡萄糖可為PAL和POD的代謝提供直接的或間接的碳骨架和氫供體。本研究選用開(kāi)花時(shí)間都比較接近,且既可以食用又可以藥用的3種十字花科植物薺菜[Capsellabursa-pastoris(L.)Medic]、獨(dú)行菜(LepidiumapetalumWilld)和播娘蒿(Descurainiasophia(L.)Webb)作為材料,比較了在正常生理環(huán)境下3種植物花期不同器官的PAL,POD,α-淀粉酶的活性和可溶性蛋白、H2O2的含量,旨在探討它們之間的相互作用及其與藥用成分之間的關(guān)系,為提高十字花科植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值提供新的依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面十字花科植物薺菜、獨(dú)行菜、播娘蒿,分別于2004～2006年4月16～26日采自河南師范大學(xué)生物園。1.2方法1.2.1pal和pod的測(cè)定分別取植物的根、莖、葉、花,清洗干凈后,用濾紙蘸干,稱取2g,加適量的石英砂在冰浴下充分研磨,然后按M∶V=1∶1(根為1∶2)加入樣品緩沖液,其中POD的樣品緩沖液為pH7.0,50mmol/L磷酸緩沖液;α-淀粉酶為pH5.0,10mmol/L醋酸緩沖液;PAL為pH8.8,5mmol/L巰基乙醇,0.1mol/L硼酸緩沖液;H2O2樣品則在加入0.5mL蒸餾水和3mL丙酮?jiǎng)驖{后,加入同體積的萃取液V(CCl4)∶V(CHCl3)=3∶1進(jìn)行萃取脫色;所有的樣品在勻漿后,10000r/min,4℃離心10～20min,離心后取上清直接測(cè)定或儲(chǔ)藏于-20℃?zhèn)溆?。POD的活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法,以單位鮮重的每分鐘光吸收度的變化值為酶活力,即△OD470nm/(min·g)表示;采用Bradford比色法于595nm處測(cè)定可溶性蛋白含量,以小牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線;用β-極限糊精法測(cè)定α-淀粉酶活性,測(cè)定波長(zhǎng)為560nm,酶活單位為:μg/(h·g);PAL的活性測(cè)定采用巰基乙醇法,酶活單位為:ΔOD290nm/(h·g);H2O2含量的測(cè)定用硫酸鈦法,測(cè)定波長(zhǎng)為410nm,以其消光系數(shù)ξ=0.28L/(mol·cm)計(jì)算其含量,單位為mmol/g。1.2.2酶同工酶電泳采用垂直板聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳方法,電泳完后參照胡能書的方法,POD用聯(lián)苯胺染色,α-淀粉酶用稀碘液顯色。2結(jié)果與分析2.13-淀粉酶活性由表1可以看出,所測(cè)的POD活性在3種植物中雖有差異,但變化趨勢(shì)相同,根的POD活性都比較高,其次是莖、花、葉,由于在試驗(yàn)期,獨(dú)行菜花的采集較為困難而缺失花的數(shù)據(jù)。α-淀粉酶在薺菜的花、播娘蒿葉和花、獨(dú)行菜的根中有較高的活性,且獨(dú)行菜各器官中α-淀粉酶活性較其他2種植物都高;薺菜根PAL活性明顯比其他2種植物要高,而薺菜和播娘蒿莖的PAL活性也相對(duì)較高,在播娘蒿和獨(dú)行菜葉中不能檢測(cè)到PAL活性。2.23播關(guān)于在菜中的可溶性蛋白表2中可溶性蛋白含量在薺菜各器官中表現(xiàn)為根<莖<葉<花,在獨(dú)行菜中趨勢(shì)也類似,播娘蒿各器官中可溶性蛋白含量極高,其中根和花器官中尤其明顯。在薺菜葉和播娘蒿花中H2O2含量較高,而它們根中由于H2O2含量太低而無(wú)法檢測(cè)到。2.33不同枝、葉、花、根、莖、葉從圖1Ⅰ、Ⅱ可以看出,不同植物不同器官POD、α-淀粉酶同工酶譜條帶不同,如Ⅰ中薺菜根有3條主帶,莖有4條主帶,花有4條主帶,其中根、莖、花有3條共有酶帶;獨(dú)行菜根、莖、葉有3條共有酶帶,其分別有6,3,4條主帶;播娘蒿根、莖有3條主帶,葉、花有2條主帶,它們有2條共有條帶;Ⅱ中薺菜根、莖、葉、花中有2～4條主帶,有2條共有條帶;獨(dú)行菜中只有1條主帶;播娘蒿的莖、葉、花器官有共有條帶,而根有其獨(dú)特條帶。顯示了其組織特異性和種間差異。3pod與播婆蒿、自由生長(zhǎng)的同工酶譜帶十字花科植物全世界約375屬,3200種,我國(guó)有95屬約400種,其中大多數(shù)是重要的經(jīng)濟(jì)作物和藥用植物。本試驗(yàn)首次探索了3種既可食用又可藥用的十字花科植物,花期的根、莖、葉、花4種器官的POD,PAL,α-淀粉酶等生化指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明:3種植物的不同器官中均有較高的POD活性,尤其是根和莖中的POD活性較高,3種植物中又以薺菜根的POD活性最高。由于POD是一類重要的氧化還原酶類,參與植物許多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。根中較高的POD活性是由于根部與土壤環(huán)境的接觸最為直接和密切,其主要功能是吸收養(yǎng)分和貯存物質(zhì)以及抵御外界傷害性刺激,較高的POD活性可以對(duì)抗因環(huán)境改變?cè)斐傻闹参矬w內(nèi)的活性氧上升,對(duì)植物起到保護(hù)作用。而且POD催化木質(zhì)素生物合成中最后一步反應(yīng),根和莖部木質(zhì)化程度較高,較高的POD活性與其功能相適應(yīng)。POD也參與葉綠素的降解,因此葉中的POD活性較低。同工酶譜常被用于種質(zhì)資源和遺傳進(jìn)化的研究,POD同工酶譜已用于多種十字花科植物如大白菜、油菜、諸葛菜、藍(lán)花子等的分類及品種鑒定,相同的品種有相同的同工酶譜帶。本試驗(yàn)所研究的3種植物也具有相同的POD同工酶譜帶(Rf=0.35),但是,薺菜的POD同工酶譜帶以較大的核質(zhì)比譜帶為主,而獨(dú)行菜和播娘蒿的同工酶譜帶則主要為核質(zhì)比較小的條帶。后兩者的種子是中藥葶藶子,其主要成分是由芥子酸和膽堿生成的酯類物質(zhì)芥子堿(sinapine)。芥子堿是一種非常有價(jià)值的天然抗氧化劑,在抗衰老藥物的研究中具有重要意義。由此可見(jiàn),POD同工酶譜不僅可以作為分類依據(jù),也可以研究植物的功用,具有相同藥理作用的植物可以有類似的同工酶譜。本試驗(yàn)結(jié)果表明,PAL在3種植物中除了在薺菜根部的活性最高外,莖中活性較高,由于PAL與細(xì)胞分化也有很大關(guān)系,而PAL催化的苯丙烷類代謝中生成的肉硅酸等中間產(chǎn)物又可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、香豆素、阿魏酸、綠原酸、類黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物,其中阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物,具有重要的藥用價(jià)值:阿魏酸能治療多種心腦血管疾病;Rubery和Notheote在多種植物中發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)化組織中含有較高的PAL活性,木質(zhì)素含量與PAL,POD活性成正相關(guān)。莖的主要功能是在根和葉等組織間運(yùn)輸物質(zhì),且隨著植物的不斷生長(zhǎng),其木質(zhì)化速度也隨之加快,故其PAL活性較高。由于PAL參與的苯丙烷類代謝途徑所產(chǎn)生的許多藥用成分如香豆素、阿魏酸等也是POD的底物。本試驗(yàn)證明,獨(dú)行菜和播娘蒿的根中的POD活性較高而莖中PAL活性較高,從而有利于植物的藥用成分積累。播娘蒿、獨(dú)行菜的特征性成分黃酮類,具有抗氧化、抗癌及抗微生物和除臭的功能,與該兩種植物止血、消炎的功效有關(guān)。晁志等研究發(fā)現(xiàn),益母草中生物堿成分對(duì)大鼠有利尿作用。本試驗(yàn)供試植物薺菜、獨(dú)行菜和播娘蒿中的膽堿、乙酰膽堿等都屬于該成分,由此推測(cè)這3種植物的清熱利尿之效可能與其中的生物堿成分有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,POD和PAL活性高的器官其H2O2含量則低,由于H2O2是一種活性氧,它可以生成極具破壞性的OH,OH可啟動(dòng)連續(xù)性的脂質(zhì)過(guò)氧化作用,不僅只是細(xì)胞代謝中有害的副產(chǎn)品,它同時(shí)對(duì)植物抗病基因的表達(dá)和局部細(xì)胞的凋亡具有重要的調(diào)控作用,且H2O2是POD的特異性底物,PAL也是植物體內(nèi)的一種重要的抗性酶,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和抗病蟲(chóng)中起著非常重要的作用,其產(chǎn)物阿魏酸對(duì)活性氧如OH,O??2Ο2-?和H2O2有較強(qiáng)的清除能力。另外苯丙烷類代謝的大量產(chǎn)物直接或間接地為POD提供了氫供體,如POD參與阿魏酸等酚類化合物的氧化。薺菜的POD和PAL含量在根、莖、葉、花器官中較高,從而證實(shí)了薺菜全株入藥的正確性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,可溶性蛋白在葉和花中含量較高,是由于葉是光合器官,雖然葉中可溶性蛋白含量較高,但其光合酶系統(tǒng)占主要成分,使得其他酶含量較低?；ㄊ侵参锏纳称鞴?是在花期代謝最旺盛的器官。不僅其可溶性蛋白含量高而且淀粉酶活性也高,為其提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。這也是花具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的原因。根和莖部也含有較高的α-淀粉酶活性,可使其貯存的淀粉迅速分解,從而為植株的生長(zhǎng)發(fā)育和其他物質(zhì)的合成提供能量和碳骨架,糖的分解也為POD提供氫供體。而葉相對(duì)較低的淀粉酶活性使得葉有利于將新合成的單糖或寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)到其他器官。本試驗(yàn)結(jié)果顯示獨(dú)行菜和播娘蒿具有較高的淀粉酶活性和相對(duì)集中的同工酶譜帶,而