植物萌發(fā)的發(fā)病機(jī)制

植物萌發(fā)的發(fā)病機(jī)制

大多數(shù)有性植物通過有性生殖和種子繁殖后代，保持種子繁殖，并以種子為成功的后代來決定植物群的繁殖和生存，植物進(jìn)入自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的時間，直接影響植物產(chǎn)量。因此,種子萌發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)意義。由于種子萌發(fā)容易受到機(jī)械傷害、病害和環(huán)境脅迫的影響,種子萌發(fā)也被認(rèn)為是植物生活周期中最重要和最脆弱的階段;對于一年生和二年生植物,種子的成功萌發(fā)則更為重要。種子萌發(fā)起始于水分吸收(吸脹),結(jié)束于胚軸的伸出,通常是胚根突破周圍結(jié)構(gòu)。胚軸突破周圍結(jié)構(gòu)也被稱為“可見萌發(fā)”,此時,種子已經(jīng)完成萌發(fā)。萌發(fā)(germination)的術(shù)語通常被用來表示它的完成,例如,“50%的萌發(fā)”表示一個種子批中50%的種子已經(jīng)萌發(fā)。狹義的萌發(fā)(sensustrictogermination)不包括幼苗生長,“萌發(fā)的幼苗(germinatingseedling)”的術(shù)語具有明顯的錯誤。萌發(fā)有時也被種子檢驗(yàn)員稱為從土壤中出苗,因?yàn)樗麄兊呐d趣在于檢測幼苗的建成。一個更為準(zhǔn)確的術(shù)語是“出苗(seedlingemergence”或者是“成苗(seedlingestablishment)”。在新生幼苗中發(fā)生的事件,例如主要貯藏物的動員,也不屬于萌發(fā)的內(nèi)容,它們是萌發(fā)后的事件。Bewley等注意到有大量關(guān)于種子生理、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的文獻(xiàn),是利用已萌發(fā)的種子(或者幼苗)作材料來研究種子萌發(fā)的機(jī)制,錯誤地描述種子萌發(fā)的結(jié)論;因此,從這些文獻(xiàn)中獲取信息時必須小心。在許多栽培作物特別是一些重要的禾谷類作物,例如水稻、小麥和玉米中,由于長期的栽培選擇,即種子迅速和整齊的萌發(fā),使其種子在成熟后期遇到連續(xù)陰雨時會產(chǎn)生收獲前萌發(fā),也稱穗萌(preharvestingsprouting)。穗萌是種子在植株上的一種特殊萌發(fā),在禾谷類作物種子和糧食生產(chǎn)中已經(jīng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是目前全球關(guān)注的重要問題。Rajjou等提示,從1900年以來,發(fā)表了25000多篇關(guān)于種子萌發(fā)的文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)充分表明了種子萌發(fā)在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和園藝生產(chǎn)中的重要性以及在不同物種中的復(fù)雜性。Nonogaki等認(rèn)為,盡管獲得了種子萌發(fā)過程中一些基因表達(dá)的信息,但由于種子萌發(fā)事件的復(fù)雜性以及不同植物種子的遺傳多樣性,完成種子萌發(fā)的關(guān)鍵事件仍未確定。本文綜述了近年來種子萌發(fā)及其調(diào)控的研究進(jìn)展,主要包括種子萌發(fā)過程中的重要生理變化,與種子萌發(fā)有關(guān)的蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)組,以及種子萌發(fā)的激素調(diào)節(jié),試圖為解釋種子萌發(fā)的機(jī)制,促進(jìn)引種時種子能迅速而整齊地萌發(fā)并減輕或防止收獲前穗萌提供新的研究思想。1種子萌發(fā)率測定當(dāng)具有生活力的干燥種子吸收水分時,一系列的事件被啟動,最終引起胚通常是胚根的伸出,表明種子已成功地完成萌發(fā)。種子萌發(fā)過程中發(fā)生的細(xì)胞變化是復(fù)雜的,當(dāng)吸脹時,代謝活性迅速增加,由成熟干燥和干燥種子時氧化所引起的結(jié)構(gòu)傷害被恢復(fù),基本的細(xì)胞活性被重新激活,胚為出苗和隨后的早期幼苗生長作好準(zhǔn)備(圖1)。1.1種子吸脹檢測種子萌發(fā)通常被描述為一個由3個階段所組成的過程,隨著水分吸收開始(階段I,吸脹作用),重新開啟代謝過程(階段II),胚根突破周圍結(jié)構(gòu)完成萌發(fā)(階段III)(圖1)。干燥種子具有非常低的水勢,能使水分迅速地進(jìn)入。由于這個過程被襯質(zhì)勢(matrixpotential)所驅(qū)動,吸脹作用也在死種子中發(fā)生。水分吸收的動力學(xué)受種子結(jié)構(gòu)的影響,水分不可能均等地進(jìn)入種子的所有部位。最初,吸脹作用引起襯質(zhì)例如細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)的貯藏多聚物的水合。水分吸收隨著時間的延長而增加是種子內(nèi)水合細(xì)胞數(shù)量的增加,而不是所有細(xì)胞水合作用一致增加的結(jié)果。利用質(zhì)子核磁共振微成像(protonnuclearresonancemicro-imaging)技術(shù)能夠檢測到吸脹過程中的水合模式。在煙草種子中,水分首先到達(dá)珠孔端胚乳和胚根的頂部,使該區(qū)域的代謝作用迅速恢復(fù)。許多其他的植物種子包括小麥種子也是通過珠孔發(fā)生類似的水分吸收模式;但也有例外,例如西部白松,種子合點(diǎn)端的子葉是最先水合的部位。在吸脹過程中,種子迅速膨脹,其大小和形狀也發(fā)生變化。Robert等發(fā)現(xiàn),乙烯突變體的種子形狀和吸脹行為不同于野生型種子。吸脹種子的大小和形狀變化差異可用于大規(guī)模的突變體篩選,計算方法促進(jìn)了圖像時間序列(imagetimeseries)的高通量分析。種子的最初吸脹作用常常伴隨著細(xì)胞溶質(zhì)的大量滲漏。滲漏是由快速和/或者不均勻的重新水合作用所引起的膜和細(xì)胞分室作用被傷害的結(jié)果。在種子成熟干燥和隨后的貯藏過程中,細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)被維持在凝膠相;當(dāng)重新水合時,轉(zhuǎn)變成為液晶相;在相變過程中,一些膜被傷害,導(dǎo)致溶質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)滲漏。滲漏也能降低種子內(nèi)抑制物的濃度,從而促進(jìn)種子萌發(fā)。1.2種子釋放和吸脹在種子吸脹開始后的幾分鐘,O2的吸收和CO2的釋放迅速增加。成熟的干燥種子含有內(nèi)膜分化不完全的線粒體以及呼吸作用必需的功能酶例如三羧酸循環(huán)的酶和末端氧化酶,在吸脹開始后的幾小時能通過氧化磷酸化提供足夠的ATP。在干燥種子中,這些酶可能被線粒體專一的胚胎發(fā)生晚期豐富(lateembryogenesisabundant,LEA)蛋白保護(hù)。在吸脹完成后(時期II),當(dāng)線粒體經(jīng)過修復(fù)和復(fù)制時,線粒體的呼吸作用增加。在種子中線粒體有兩種不同的發(fā)育模式。在貯藏淀粉為主的種子例如豌豆、綠豆和豇豆中,以預(yù)存的線粒體被修復(fù)和重新活化為主;而在貯藏油為主的種子例如花生、蓖麻和南瓜中,新線粒體的生物發(fā)生是主要的。糖酵解和戊糖磷酸途徑也在吸脹的種子中具有活性。在吸脹過程中或者吸脹后,許多種子經(jīng)歷短暫的厭氧條件,導(dǎo)致乙醇的產(chǎn)生。當(dāng)線粒體ATP的產(chǎn)生受到低氧限制時(常常是由于胚周圍結(jié)構(gòu)的限制),糖酵解途徑占優(yōu)勢;相反,當(dāng)線粒體變得活躍時,戊糖磷酸途徑占優(yōu)勢。最近,我們發(fā)現(xiàn)楊樹種子在吸脹過程中的呼吸速率迅速增加,吸脹0.5h時的種子呼吸速率是干燥種子的5倍;細(xì)胞色素c氧化酶途徑抑制劑KCN,交替氧化酶途徑抑制劑水楊基羥肟酸(salicylhydroxamicacid)和解偶聯(lián)劑2,4-二硝基酚(2,4-dinitrophenol)顯著地抑制楊樹種子的萌發(fā)(宋松泉等,未發(fā)表數(shù)據(jù)),表明呼吸作用(能量產(chǎn)生)在種子萌發(fā)中起重要作用,但作用方式還不清楚。1.3種子修復(fù)和活性基因組DNA的損傷包括在延長干藏過程中端粒順序的逐漸喪失,鏈斷裂,以及由溫度、水分、氧氣和活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)積累所引起的其他類型的DNA損傷。染色體損傷的積累和/或者這種傷害在種子吸脹過程中不能被修復(fù)似乎是種子貯藏過程中生活力喪失的重要因素。玉米種子成熟過程中的脫水和吸脹過程中的重新水合導(dǎo)致大量的單鏈DNA斷裂,其中大部分傷害可能歸因于吸脹傷害。這包括萌發(fā)早期DNA中缺嘌呤/缺嘧啶位點(diǎn)(apurinic/apyrimidinicsite)的產(chǎn)生和修復(fù)。DNA損傷明顯地是種子萌發(fā)過程中的一種主要障礙,能被DNA連接酶(DNAligase)修復(fù)。當(dāng)擬南芥種子吸脹時,DNA連接酶的表達(dá)被迅速活化;在核DNA復(fù)制或者細(xì)胞分裂缺乏時,觀察到高水平的DNA重新合成,表明在DNA修復(fù)中的作用。在擬南芥中,植物專一的DNA連接酶VI的失活使種子萌發(fā)延遲。atlig6突變體對種子老化也表現(xiàn)出過敏性反應(yīng),表明AtLIG6是擬南芥種子質(zhì)量和壽命的主要決定子。在苜蓿種子萌發(fā)的早期階段,與氧化損傷的DNA修復(fù)有關(guān)的酶[例如,甲酰嘧啶-DNA糖基化酶(formamidopyrimidine-DNAglycosylase)和8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶/裂解酶(8-oxoguanineDNAglycosylase/lyase)]被上調(diào)也支持DNA的修復(fù)是種子萌發(fā)所需要的。煙堿是多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP;與DNA的修復(fù)有關(guān)]的抑制劑,在種子萌發(fā)過程中這個化合物必須被降解。在擬南芥成熟種子中,編碼煙酰胺酶(nicotinamidase)的基因NIC2被高水平地表達(dá)。敲除突變體nic2-1的種子表現(xiàn)出煙酰胺酶活性降低和延遲萌發(fā),說明煙酰胺被NIC2正常地代謝,從而釋放對PARP活性的抑制,允許DNA修復(fù)發(fā)生。在種子干燥和/或者貯藏過程中,由于異常氨基酸的形成也發(fā)生蛋白質(zhì)的傷害;這樣可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯誤折疊,引起蛋白質(zhì)功能的下降或者喪失。PIMT通過催化異常的L-異天冬氨酰殘基轉(zhuǎn)換成為正常的L-天冬氨酰在種子傷害蛋白的修復(fù)中起重要作用。在誘變處理的擬南芥種子中,PIMT1(編碼PIMT的一個基因)的過表達(dá)減少蛋白質(zhì)中異常氨基酸殘基的積累,引起種子活力和壽命的增加;相反,PIMT1的降低表達(dá)增加新鮮收獲的成熟干燥種子中蛋白質(zhì)L-異天冬氨酰殘基的積累,導(dǎo)致脅迫條件下種子活力的下降,以及對老化處理的過敏性反應(yīng)。PIMT2主要定位于內(nèi)膜系統(tǒng),例如線粒體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì),提出PIMT2在一些亞細(xì)胞中參與蛋白質(zhì)的修復(fù)。2通過蛋白質(zhì)合成和翻譯后的種子萌發(fā)控制2.1種子萌發(fā)過程中的轉(zhuǎn)錄和使用在干燥的擬南芥和大麥種子中存在多于12000種mRNA,在干燥的水稻種子中含有超過17000種mRNA。這些mRNA被稱為貯存的或者殘留的信息,來源于種子發(fā)育,并在細(xì)胞脫水中存留;但是,這些信息在干燥種子中的定位是不清楚的,它們可能被束縛在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的信使核蛋白復(fù)合物(messengerribonucleoproteincomplexes)中。在干燥種子中,例如小麥胚含有蛋白質(zhì)重新合成所需要的全部組分。在重新水合的幾分鐘內(nèi),能利用存留的mRNA,核糖體被轉(zhuǎn)變成為多聚核糖體蛋白合成復(fù)合物(polysomalprotein-synthesizingcomplexes)。轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制劑的實(shí)驗(yàn)支持?jǐn)M南芥種子萌發(fā)過程中貯藏mRNA的參與。RNA聚合酶II的抑制劑α-鵝膏蕈堿(α-amanitin)不抑制種子萌發(fā),而蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)明顯地阻止胚根的伸出(宋松泉等,數(shù)據(jù)待發(fā)表)。值得注意的是,利用存留的mRNA的重新蛋白合成足夠允許種子完成萌發(fā),但是在吸脹早期哪些存留的mRNA是萌發(fā)完成所必需的仍然不清楚。2.2關(guān)于種子萌發(fā)過程中met代謝的觀點(diǎn)He等利用蛋白質(zhì)組技術(shù)構(gòu)建了萌發(fā)水稻種子的代謝和調(diào)節(jié)途徑。擬南芥、水稻、玉米、豌豆、番茄、蓖麻、麻瘋樹和海棗種子萌發(fā)過程中的差異蛋白質(zhì)組分析表明,有許多蛋白被差異積累。這些蛋白主要涉及代謝作用(包括氨基酸、脂類、氮和硫、糖、輔因子和次生代謝),能量產(chǎn)生(糖酵解、戊糖磷酸途徑、三羧酸循環(huán)和呼吸作用),轉(zhuǎn)錄,蛋白質(zhì)合成與目標(biāo)(包括蛋白質(zhì)合成、折疊和水解),細(xì)胞生長與結(jié)構(gòu)(細(xì)胞骨架、生長調(diào)節(jié)),細(xì)胞防御與救援(防御相關(guān)蛋白、去毒和脅迫反應(yīng))以及貯藏蛋白(圖2)。應(yīng)該注意的是,由于不同物種的干燥種子中所含的mRNA的種類與豐度不同,上述蛋白質(zhì)組研究中所涉及的種子萌發(fā)條件不一致,并且蛋白質(zhì)組分析所鑒定的蛋白數(shù)量有限,要比較上述物種萌發(fā)過程中同一蛋白的積累模式是困難的。根據(jù)差異積累的蛋白質(zhì)組研究,發(fā)現(xiàn)與甲硫氨酸(Met)代謝有關(guān)的一些蛋白例如S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,AdoMet)合成酶[29,30,31,36,41,42]、Met合酶、不依賴鈷胺素的Met合酶(cobalaminindependentMetsynthase)、以及半胱氨酸合酶在種子萌發(fā)過程中增加積累;這些結(jié)果與Rajjou等的觀點(diǎn)一致,他們認(rèn)為Met代謝在種子萌發(fā)中起重要作用。在由植物合成的必需氨基酸中,Met是一種重要的代謝物,因?yàn)樗粌H是蛋白質(zhì)合成的底物,而且是AdoMet(一種普遍的甲基供體)、多胺、植物激素乙烯和維生素生物素的前體。已經(jīng)提出,在所有的生物中,Met代謝是一種看家機(jī)制(housekeepingmechanism)。在擬南芥、水稻、玉米、豌豆、麻瘋樹、海棗和蓖麻種子萌發(fā)過程中,增加積累一些與糖酵解、三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑和能量產(chǎn)生有關(guān)的蛋白,為種子萌發(fā)提供能量和碳骨架。在25℃(萌發(fā))、43℃(不萌發(fā))、(43+25)℃(恢復(fù)萌發(fā))和ABA(不萌發(fā))中萌發(fā)的水稻種子的蛋白質(zhì)組分析表明,增加積累蛋白OsJ_19262(6-磷酸果糖激酶3)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(劉樹君等,未發(fā)表數(shù)據(jù))。這些結(jié)果表明能量供應(yīng)是種子完成萌發(fā)所必需的,但不是足夠的。與蛋白合成相關(guān)的蛋白例如多聚腺苷酸-結(jié)合蛋白、真核翻譯起始因子5A-3和因子3亞基I、50S核糖體蛋白L1,葉綠體翻譯延長因子EF-Tu和線粒體延長因子Tu;在蛋白折疊中涉及的蛋白dnak-類型的分子伴侶熱休克蛋白(HSP)70,線粒體HSP60和新生多肽復(fù)合物結(jié)構(gòu)域蛋白;與蛋白水解有關(guān)的蛋白包括20S蛋白酶體α-亞基、α-類型5、α-類型6和α-類型7,26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4同源物和6A同源物等在種子萌發(fā)過程中增加積累。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白,14-3-3蛋白和14-3-3家族蛋白,類14-3-3蛋白,核苷二磷酸激酶和激酶I,蛋白激酶APK18和假定的蛋白激酶,依賴-Ca2+蛋白激酶、腺苷酸激酶和假定的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶也在種子萌發(fā)過程中增加積累。盡管這些蛋白在種子萌發(fā)過程中被增加積累,但它們在種子萌發(fā)完成中的作用仍然不清楚。液泡ATPaseβ-亞基、依賴電壓的陰離子通道和P-類型H+-ATPase在種子萌發(fā)過程中增加積累,這些蛋白與運(yùn)輸有關(guān),可能通過改變細(xì)胞的水勢,從而促進(jìn)細(xì)胞伸長。與細(xì)胞生長和結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白,例如肌動蛋白1和7,肌動蛋白解聚因子和類肌動蛋白解聚因子蛋白,α-2,4、α-3,5和β-2微管蛋白,微管蛋白α-1鏈和β-1鏈,以及β-伸展蛋白(β-expansin)在種子萌發(fā)過程中增加積累,表明這些蛋白與種子的萌發(fā)直接相關(guān)。擬南芥野生型種子中的α-2,4微管蛋白的豐度較低,隨著種子萌發(fā)其豐度明顯增加;多效唑(paclobutrazol)抑制種子萌發(fā),多效唑處理的種子中α-2,4微管蛋白的豐度類似于干燥種子。擬南芥GA缺陷型突變體種子(ga1mutantseed)中的α-2,4微管蛋白的豐度類似于野生型干燥種子,但不能萌發(fā);當(dāng)在萌發(fā)介質(zhì)中添加GA4+7時,種子的萌發(fā)率達(dá)100%,α-2,4微管蛋白的豐度顯著增加,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于完全萌發(fā)的野生型種子。水引發(fā)(hydropriming)和滲透引發(fā)(osmopriming)促進(jìn)擬南芥種子的萌發(fā)速率和β-2微管蛋白的增加積累。乙烯生物合成的關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylateoxidase,ACO)在種子萌發(fā)過程中也增加積累,已經(jīng)證明乙烯能促進(jìn)種子萌發(fā)和拮抗ABA的作用。已經(jīng)提出萌發(fā)過程本身就是一種“脅迫”,細(xì)胞防御與救援蛋白的積累可能是種子萌發(fā)過程中活化的自我防御機(jī)制的一部分,在種子萌發(fā)中起間接的(保護(hù))作用。此外,在種子萌發(fā)過程中,增加積累一些貯藏蛋白;根據(jù)這些蛋白的實(shí)驗(yàn)分子量小于理論分子量,推測它們可能是貯藏蛋白的降解產(chǎn)物。應(yīng)該注意的是,在種子萌發(fā)過程中,還有不同類型的蛋白下調(diào),其中一部分蛋白可能與種子萌發(fā)有關(guān),這里因篇幅的限制,就不討論了。2.3翻譯后蛋白修飾在干燥種子和萌發(fā)的種子中,有許多蛋白受到翻譯后修飾,這些修飾通過影響蛋白質(zhì)的功能包括定位、復(fù)合物的形成、穩(wěn)定性和活性等調(diào)節(jié)種子的萌發(fā)。2.3.1種子貯藏過程的基化作用萌發(fā)伴隨著種子中蛋白質(zhì)氧化還原狀態(tài)的廣泛變化。在禾谷類作物中,干燥種子的淀粉胚乳和胚中的蛋白質(zhì)主要以氧化狀態(tài)(S-S)存在,在吸脹后被轉(zhuǎn)化成為還原或者巰基(-SH)狀態(tài)。硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)是一種調(diào)節(jié)二硫鍵的蛋白,在氧化–還原作用的轉(zhuǎn)換中起重要作用。當(dāng)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)存在、Trx被酶促還原時,Trx作為一種萌發(fā)早期的信號起作用,通過(a)還原貯藏蛋白,增加它們的可溶性和對蛋白水解的敏感性;(b)減少和失活抑制專一淀粉酶和蛋白酶的二硫健蛋白,促進(jìn)貯藏淀粉和蛋白的降解;以及(c)還原性地活化在種子萌發(fā)中具有功能的酶,促進(jìn)貯藏物的動員。在模式豆科植物苜蓿種子的萌發(fā)過程中已經(jīng)觀察到類似的結(jié)果,表明Trx像在單子葉植物中所描述的那樣在雙子葉植物種子萌發(fā)過程中起作用。這些研究提出在成熟干燥種子中蛋白質(zhì)組的氧化形式引起代謝的靜止;而種子萌發(fā)過程中在Trx存在時通過蛋白質(zhì)二硫鍵的還原,這些氧化形式的蛋白質(zhì)被還原。另一種蛋白質(zhì)的氧化修飾產(chǎn)生于ROS引起的蛋白質(zhì)羰基化作用(proteincarbonylation)。在擬南芥種子的吸脹過程中,不同的羰基化蛋白積累。這個過程的靶子是專一的代謝酶、翻譯因子和一些分子伴侶。盡管在各種模式系統(tǒng)中常常認(rèn)為羰基化蛋白的積累是在老化的背景下產(chǎn)生;顯然在種子中不是這樣,因?yàn)楹写罅眶驶鞍椎臄M南芥種子能夠迅速地萌發(fā)和產(chǎn)生有活力的幼苗。似乎觀察到的蛋白質(zhì)羰基化模式的專一變化對于抵消和/或者利用由萌發(fā)種子代謝活性恢復(fù)所產(chǎn)生的ROS是需要的。觀察到的高豐度種子貯藏蛋白的羰基化作用可能反映了它們在清除種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的活性氧的作用。此外,已經(jīng)提出這種羰基化作用可能通過降低蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和促進(jìn)蛋白水解來增加幼苗建成過程中種子貯藏蛋白的動員。2.3.2aba信號調(diào)節(jié)在細(xì)胞信號中磷酸化和去磷酸化代表一種普遍的調(diào)節(jié)機(jī)制。已經(jīng)證明一組蛋白磷酸酶和蛋白激酶通過ABA信號的調(diào)節(jié)控制種子萌發(fā)。同樣,在DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)翻譯中涉及的酶的磷酸化對于種子萌發(fā)的分子控制也是非常重要的。2.3.3種子吸脹機(jī)制NO是生物系統(tǒng)中的一種主要的和多功能的中介物。然而,盡管已經(jīng)證明NO調(diào)節(jié)種子的代謝活性,但它在種子萌發(fā)控制中的作用方式仍然不清楚。已經(jīng)報道,NO能與金屬蛋白的過渡金屬結(jié)合(金屬的亞硝基化)或者引起半胱氨酸的S-亞硝基化作用(S-nitrosylation)或者酪氨酸的硝化作用(tyrosinenitration)。在吸脹1h的擬南芥種子中,已觀察到NO的短暫爆發(fā)。此外,在吸脹24h的高粱胚軸中已觀察到一些硝化蛋白增加。蛋白硝化作用(proteinnitration)是一種硝化應(yīng)激(nitrosativestress)的生物學(xué)標(biāo)記,可能參與植物中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換或者信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。有趣的是,鉬輔因子硫化酶(molybdenumcofactorsulfurase,ABA3,ABA合成的最后步驟涉及的一種酶)的酪氨酸硝化作用已經(jīng)在擬南芥中報道。在種子吸脹過程中,由這種機(jī)制引起的ABA合成的失活可能有助于種子的萌發(fā)。此外,增加的證據(jù)表明蛋白質(zhì)的S-亞硝基化作用可能調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過程中的代謝和能量過程。除了上述翻譯后修飾外,已經(jīng)證明蛋白質(zhì)生物素化(biotinylation)、糖基化(glycosylation)、泛素化(ubitinylation)、法尼基化(farnesylation)和乙?；?acetylation)也對種子萌發(fā)起調(diào)節(jié)作用。3植物激素對種子萌發(fā)的調(diào)節(jié)3.1aba基因家族在種子萌發(fā)過程中的作用機(jī)理脫落酸是種子休眠的正調(diào)節(jié)劑,是萌發(fā)的負(fù)調(diào)節(jié)劑,在種子休眠和萌發(fā)中起主要作用。許多ABA缺陷型的物種表現(xiàn)出萌發(fā)能力增加,有時產(chǎn)生胎萌的種子;而過量積累ABA的突變體和轉(zhuǎn)基因系表現(xiàn)出加強(qiáng)休眠。這些基因型已經(jīng)證明了ABA在種子發(fā)育過程中的主要功能是抑制提前萌發(fā)和誘導(dǎo)初生休眠。同樣,利用ABA生物合成抑制劑的實(shí)驗(yàn)表明,在吸脹種子中ABA的重新合成對于種子休眠的維持是必需的。細(xì)胞內(nèi)的ABA含量被生物合成和降解代謝之間的平衡所調(diào)節(jié)。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素二加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenases,NCED)催化9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素、9-順式-新黃質(zhì)和9’-順式堇菜黃質(zhì)的裂解,這是ABA生物合成的主要調(diào)節(jié)步驟。玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶(zeaxanthinepoxidase,ZEP),一種葉黃素環(huán)化酶,也被認(rèn)為在ABA生物合成過程中具有調(diào)節(jié)功能。ABA被羥基化作用或者與糖結(jié)合失去活性。P450單加氧酶的CYP707A家族成員編碼ABA8’-羥化酶(8’-hydroxylase),這是ABA8’-羥化作用途徑中的關(guān)鍵步驟,在ABA含量的控制中起調(diào)節(jié)作用。到目前為止研究過的所有物種都以多基因家族的形式編碼NCED和CYP707A,這些成員的不同結(jié)合有助于組織和環(huán)境的專一調(diào)節(jié)。在發(fā)育過程中積累和在干燥種子中存在的ABA隨著種子吸脹下降。這種下降在休眠(Cvi)和非休眠(Col)的擬南芥種子中發(fā)生,主要取決于CYP707A2的活性。在Col和Cvi擬南芥種子中,CYP707A2基因在吸脹開始后2~3h被誘導(dǎo),導(dǎo)致ABA含量的迅速下降,暗示與CYP707A2蛋白的重新合成關(guān)系密切。這種早期誘導(dǎo)被幾種因子,例如硝酸鹽、NO和后熟所調(diào)節(jié)。休眠的Cvi種子和熱抑制的Col種子在吸脹初期表現(xiàn)出ABA含量下降,然后增加。因此,ABA含量的降低可能是種子萌發(fā)的一個前提條件。擬南芥分子遺傳學(xué)的最近進(jìn)展揭示了核心的ABA信號途徑。蛋白磷酸酶2C(proteinphosphatase2C,PP2C)基因家族的成員,包括ABA不敏感I(ABA-INSENSITIVE1,ABI1)和ABI2是中心調(diào)控因子(圖3-A),這些基因功能的缺失突變引起ABA的過敏性反應(yīng),暗示它們是ABA信號的負(fù)調(diào)控因子。隱性PP2C突變體的比較分析表明,AtPP2CA/AHG3是吸脹種子中的重要執(zhí)行者。蔗糖非發(fā)酵-1(sucrosenon-fermenting-1,SNF1)相關(guān)的蛋白激酶亞家族2(SNF1-relatedproteinkinasesubfamily2,SnRK2)的成員是一種ABA信號的關(guān)鍵正調(diào)控因子,snrk2.2snrk2.3snrk2.6三突變體在萌發(fā)過程中以及在高濕度下的胎萌中表現(xiàn)出一種強(qiáng)烈的ABA不敏感性。SnRK2能活化ABA反應(yīng)元件(ABA-responsiveelement,ABRE)結(jié)合的堿性亮氨酸拉鏈(basicleucinezipper,bZIP)轉(zhuǎn)錄因子,包括ABI5。當(dāng)SnRK2從PP2C的抑制中去抑制時,成為活性形式。ABA的受體蛋白有5種不同的形式。在這些受體中,起始蛋白(STARTprotein)的PYR1/PYL/RCAR家族以依賴于ABA的方式通過調(diào)節(jié)PP2C的活性在種子ABA響應(yīng)中起控制作用。在擬南芥基因組中,家族的14個成員(PYR1,PYL1-13)被編碼,pyr1prl1prl2prl4四重突變體表現(xiàn)出強(qiáng)烈的ABA不敏感萌發(fā)。在種子中,轉(zhuǎn)錄作用是ABA響應(yīng)中的重要步驟(圖3-B)。遺傳分析表明ABI3(B3類型)、ABI4(AP2類型)和ABI5(bZIP類型)是授予種子ABA響應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在植物界,這些轉(zhuǎn)錄因子是保守的,擬南芥中相應(yīng)的直系同源基因也存在于單子葉植物中。ABI5/TRAB1專一地與典型的ABRE結(jié)合,這是觸發(fā)ABA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用的順式元件。在吸脹的擬南芥種子中,ABI5蛋白被ABA調(diào)節(jié),是一種對ABA響應(yīng)的指示物。ABI3/VP1與RY/Sph(一個種子專一的啟動子)重復(fù)結(jié)合,而ABI4/ZmABI4與耦合元件1(couplingelement1,CE1)結(jié)合,這些因子與ABRE一道起作用以觸發(fā)ABA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用。3.2外源ga的基因在種子萌發(fā)過程中,GA能促進(jìn)種子萌發(fā)和拮抗ABA的抑制作用。具有生物活性的GA4存在于干燥種子和后熟種子中,在種子萌發(fā)后期GA4含量進(jìn)一步增加。GA20氧化酶(GA20ox)和GA3氧化酶(GA3ox)是GA生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,而GA2氧化酶催化GA的降解。Ogawa等證明,在種子萌發(fā)過程中,GA的生物合成定位于胚根、下胚軸和珠孔端胚乳。單子葉和雙子葉植物的GA生物合成酶突變體是對GA敏感的,表現(xiàn)出生長和發(fā)育的缺陷,這些缺陷能被外源GA恢復(fù)。水稻和大麥的GA敏感突變體表現(xiàn)出矮小、不育以及種子萌發(fā)過程中不能通過α-淀粉酶的誘導(dǎo)動員貯藏物。編碼GA降解代謝酶GA2ox的基因的過量表達(dá)增加GA的轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致減少小麥種子的萌發(fā)和α-淀粉酶的誘導(dǎo)。GA信號由一種可溶性受體蛋白GA不敏感的矮稈蛋白1(GA-INSENSITIVEDWARF1,GID1)感受。感受GA的機(jī)制是保守的,在擬南芥和水稻中是一致的。通過圖位克隆(map-basedcloning)技術(shù),已經(jīng)在水稻GA不敏感的突變體中鑒定了GID1基因,在大麥中鑒定了GID1的同系物GSE1,以及在擬南芥中鑒定了同系物GID1a、GID1b和GID1c。GA受體的突變產(chǎn)生類似于嚴(yán)重的GA生物合成突變的表型,但這些表型不能被外源GA恢復(fù)。GID1蛋白主要定位于細(xì)胞核,但也有定位細(xì)胞質(zhì)的報道。DELLA基因被定義為GA信號的阻遏物,因?yàn)镈ELLA基因的功能獲得突變(gain-of-functionmutation)引起減少的GA信號(例如矮小),而功能喪失突變(lossoffunctionmutation)導(dǎo)致增加的GA信號(例如苗高或者細(xì)長的表型)。GID1通過直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用增加DELLA的阻遏反應(yīng)。所有的DELLA阻遏物含有一個保守的氨基酸順序的N-末端DELLA調(diào)節(jié)區(qū)域(Asp-Glu-Leu-Leu-Ala)和一個C-末端GRAS(例如GAI、RGA和SCARECROW)功能區(qū)域。大麥的DELLA基因被稱為SLENDER1(SLN1),水稻的DELLA基因被稱為SLENDERRICE1(SLR1)。擬南芥具有5個DELLA基因,其中REPRESSOROFGA1-3(RGA)、GA-INSENSITIVE(GAI)和RGA-LIKE(RGL1)的突變能夠救援(rescue)植株的高度,RGA、RGL2和RGL1的突變能夠救援開花,而RGL2、RGA、GAI和RGL3的突變能夠救援種子的萌發(fā);DELLARGL2顯著地影響種子萌發(fā),而DELLARGA顯著地影響植株高度。GA能通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitinproteasomepathway)目標(biāo)水解DELLA蛋白,從而降低DELLA對GA反應(yīng)的阻遏作用(圖4-A)。最初,這個模型的根據(jù)是GA缺乏所引起的矮小表型能被外源GA處理救援,這種救援與DELLA蛋白的消失有關(guān)。SLY1/GID2是催化DELLA蛋白多聚泛素化的SCF(SKP1、CULLIN和F-BOX)E3泛素連接酶的F-box亞基。SCF復(fù)合物的F-box亞基通過一個C-末端的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域授予底物特異性,以及通過N-末端的F-box區(qū)域與SCF復(fù)合物的其余部分相互作用。用GA處理GA生物合成突變體ga1-3,種子在5h內(nèi)或者幼苗在10min內(nèi),通過泛素化作用導(dǎo)致DELLA蛋白的破壞;這種破壞能夠被26S蛋白酶體的抑制劑阻斷。因此,GA促進(jìn)的DELLA蛋白的多聚泛素化作用通過26S蛋白酶體使其成為靶子被降解。GID1-GA-DELLA復(fù)合物的形成觸發(fā)DELLA和F-box蛋白SLY1/GID2之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。酵母三-雜交分析(yeastthree-hybridanalysis)表明,GID1-GA-DELLA復(fù)合物的形成促進(jìn)GID2與DELLA的結(jié)合。GA促進(jìn)SLY1與GID1的共免疫沉淀(coimmunoprecipitation),暗示GID1-DELLA復(fù)合物的形成也促進(jìn)植物中GID1-DELLA-SLY1的相互作用。在GA生物合成突變體gid1和sly1/gid2中DELLA蛋白的高水平積累表明GA、GID1受體和SCF復(fù)合物的組分對于DELLA蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑水解是需要的。此外,在無細(xì)胞系統(tǒng)中,GA、GID1、SCFSLY1和泛素足夠使擬南芥DELLA蛋白發(fā)生多聚泛素化作用。在擬南芥和水稻中有一個SLY1/GID2的同系物稱為SNEEZY(SNE)或者SLY2。SNE可能在GA信號中起作用,而SLY1是DELLA蛋白積累的主要調(diào)控因子,已知在sly1sne雙突變體中SNE突變具有小的加性效應(yīng)。如果所有GA信號通過DELLA蛋白水解發(fā)生,那么,DELLA蛋白積累的水平應(yīng)該總是與嚴(yán)格的GA不敏感表型相關(guān)。在sly1和gid2F-box突變體中的情況并不是這樣,它積累多得多的DELLA蛋白,但表現(xiàn)出比GA生物合成或者GA受體無效的突變體要較少嚴(yán)格的GA不敏感表型。似乎DELLA能被一種非蛋白水解機(jī)制失活,這樣不是所有的在sly1/gid2突變體中積累的DELLA蛋白在功能上作為GA信號的阻遏物。根據(jù)下面的證據(jù)提出了GID1-GA-DELLA復(fù)合物的形成單獨(dú)阻斷DELLA抑制的模型:(1)sly1/gid2表型被GID1基因的過量表達(dá)救援,而沒有DELLA蛋白水平的降低;(2)sly1/gid2中的GA信號需要GID1-GA-DELLA復(fù)合物形成所需要的所有元件,包括GA激素的合成、GID1基因、DELLA-GID1蛋白相互作用需要的DELLA區(qū)域。根據(jù)這種情況,似乎在sly1突變體中GID1通過與DELLA蛋白結(jié)合而不是通過觸發(fā)DELLA蛋白水解引起GA信號(圖4-B)。不像擬南芥GID1a和GID1c那樣,GID1b蛋白與GA的結(jié)合具有較高的親和性,在GA缺乏時表現(xiàn)出能與DELLA相互作用。這就解釋了為什么GID1b的過量表達(dá)能更好地援救GA不敏感的sly1突變體表型的原因。在GA缺乏時,這種GA-不依賴的GID1b-DELLA結(jié)合可能提供了一種低水平的GA信號。擬南芥GID1b具有低的表達(dá)水平,暗示GID1b積累的控制對于調(diào)節(jié)基本的GA反應(yīng)可能是必需的。已有的證據(jù)表明,DELLA的活性可能被磷酸化和O-連接的N-乙酰葡糖胺(O-linkedN-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修飾影響。研究表明DELLA被磷酸化,但這種修飾在控制DELLA活性或者蛋白降解中的精確作用是不清楚的。DELLA的磷酸化最初在水稻和擬南芥中觀察到。最近的證據(jù)表明,由水稻EARLYFLOWERING1(EL1)編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白酪蛋白激酶I(Ser/ThrproteincaseinkinaseI)通過直接的蛋白磷酸化作用調(diào)節(jié)DELLASLR1。EL1作為GA信號的負(fù)調(diào)節(jié)因子和DELLA的正調(diào)節(jié)因子起作用,因?yàn)閱适L1功能導(dǎo)致與早期開花有關(guān)的GA敏感性增加以及引起種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶的增加表達(dá)。El1表型與GA處理后DELLASLR1蛋白降解速率的輕微增加有關(guān);與磷酸酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)一致,磷酸化的DELLA更穩(wěn)定。兩方面的證據(jù)建議,EL1通過磷酸化調(diào)節(jié)DELLA。首先,EL1蛋白在體外磷酸化DELLASLR1。其次,在DELLASLR1(S196A和S510A)中Ser到Ala的突變能阻斷EL1-依賴的磷酸化作用,防止基因表達(dá)的DELLA活化。此外,Ser到Asp的突變(S196D和S510D)導(dǎo)致DELLA活化的轉(zhuǎn)錄物增加積累。這就提出DELLA可能通過這2個位點(diǎn)的磷酸化被調(diào)節(jié),一個位點(diǎn)在DELLA調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi),另一個位點(diǎn)在GRAS功能區(qū)域內(nèi)。SPINDLY(SPY)編碼一種O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶,在擬南芥、水稻和小麥中負(fù)調(diào)節(jié)GA信號。在擬南芥中,spy抑制功能獲得的DELLA突變rga-Δ17。這種抑制與DELLA的消失無關(guān),而與明顯的DELLA磷酸化有關(guān)。SPYRNA干擾也抑制水稻gid2F-box突變體,而沒有DELLA的蛋白水解,但引起DELLASLR1蛋白磷酸化的增加。由于沉默SPY也抑制水稻gid1和GA生物合成突變體,似乎在spy中增加的GA信號既不需要DELLA的蛋白水解,也不需要GID1-DELLA復(fù)合物的形成。3.3鉆果大蒜類重排反應(yīng)中soaco的表達(dá)在高等植物中,乙烯通過Yang-cycle從Met合成。乙烯生物合成的限速步驟分別由2個酶家族調(diào)節(jié),ACC合酶(ACCsynthase,ACS)催化AdoMet轉(zhuǎn)換成為ACC;ACO催化ACC轉(zhuǎn)變成為活性乙烯。ACO的積累和乙烯釋放的增加與一些物種的種子萌發(fā)相聯(lián)系。已經(jīng)證明ACO轉(zhuǎn)錄物的水平被乙烯本身和其他植物激素調(diào)節(jié)。在豌豆種子萌發(fā)過程中,乙烯通過Ps-ACO1轉(zhuǎn)錄物的正反饋調(diào)節(jié)促進(jìn)乙烯的生物合成,而Ps-ACS1mRNA的水平和ACC的總含量不被乙烯處理影響。乙烯對豌豆種子萌發(fā)的促進(jìn)作用與β-1,3-葡聚糖酶有關(guān),此酶在胚軸的胚根中被專一地誘導(dǎo)表達(dá),但不在子葉中被誘導(dǎo)表達(dá)。乙烯的生物合成和響應(yīng)性被定位在豌豆胚根的延長區(qū)和分化區(qū)。用乙烯產(chǎn)生試劑乙烯利處理鉆果大蒜芥種子不顯著地影響SoACS7mRNA的水平和ACC的總含量。與這個結(jié)果一致,由氨基乙氧基乙烯甘氨酸(aminoethoxyvinylglycine,AVG)抑制ACS對種子萌發(fā)沒有明顯的影響,而Co2+抑制ACO減少鉆果大蒜芥的最大萌發(fā)百分?jǐn)?shù)。這些結(jié)果表明,SoACO2的表達(dá)與鉆果大蒜芥種子的萌發(fā)有關(guān)。乙烯信號是通過它的受體發(fā)生的;最初在擬南芥中分離到的受體突變體是乙烯三重反應(yīng)1(ethylenetripleresponse1,etr1),一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的二聚體組氨酸激酶和乙烯信號的負(fù)調(diào)控因子。在擬南芥中,已知有ETR1、ETR2、ERS1、ERS2和EIN4五種乙烯受體。當(dāng)與乙烯結(jié)合時,受體失活,相繼使組成性三重反應(yīng)1(constitutivetripleresponse1,CTR1)失活。CTR1是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,作為一種乙烯信號的負(fù)調(diào)控因子起作用。失活的CTR1引起連續(xù)的MAP-激酶級聯(lián)(MAP-kinasecascade),以及調(diào)節(jié)正調(diào)控因子EIN2和它定位在核中的轉(zhuǎn)錄因子,例如EIN3、EIL1和EREBPs/ERFs,從而活化乙烯反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)證明,在乙烯作用抑制劑2,5-降冰片二烯(2,5-norbornadiene,NBD)的實(shí)驗(yàn)中,已知的乙烯受體的信號對于許多物種的種子萌發(fā)是重要的,例如十字花科的擬南芥和家獨(dú)行菜、豆科的豌豆、茄科的煙草和許多其他物種。已經(jīng)提出幾種假說來解釋乙烯在萌發(fā)種子中的作用機(jī)制,家獨(dú)行菜種子珠孔端胚乳弱化的生化定量強(qiáng)有力地表明乙烯信號和生物合成是這個過程所需要的。通過誘導(dǎo)引起細(xì)胞壁松弛或者細(xì)胞分離的細(xì)胞壁重塑蛋白(cellwallremodelingproteins,CWRP)和/或者ROS的表達(dá),表明乙烯促進(jìn)珠孔端胚乳的弱化。已經(jīng)提出,在胚軸中乙烯通過促進(jìn)徑向細(xì)胞膨脹或者通過降低種子的基礎(chǔ)水勢(basewaterpotential)起作用。3.4aba和ga代謝種子萌發(fā)的控制是一個非常復(fù)雜的過程,它需要不同激素之間的協(xié)同作用和相互作用。已知種子的休眠狀態(tài)被ABA誘導(dǎo)和維持,而被GA解除。在更寬的植物休眠的視野中,這種ABA-GA的拮抗作用也是明顯的,它控制塊莖和休眠芽的萌發(fā)。ABA和它相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子例如ABI3/VP1被描述為古老的休眠調(diào)控因子,因?yàn)樵谙到y(tǒng)發(fā)生上它們是普遍的,因此,在