重組蛋白表達系統(tǒng)總結(jié)2012

基因工程的下游技術(shù)

重組蛋白的表達、純化和分析

重組蛋白的表達表達體系：表達載體原核受體細胞真核選擇表達載體常用的關(guān)鍵元件：啟動子和調(diào)節(jié)序列（表達強弱、細胞或組織特異性、表達調(diào)節(jié)等，如本實驗的乳糖操縱子。）融合基因（純化、標(biāo)簽，或增強蛋白可溶性等。如多聚His標(biāo)簽－6×His，便于鎳柱親和層析純化。GST融合蛋白用GST柱親和層析）分泌信號篩選標(biāo)記其它6×His

重組蛋白的純化親和層析離子交換層析凝膠過濾層析……

本單元實驗流程：細菌（pEF-GFPuv）

親和層析IPTG誘導(dǎo)細菌總蛋白重組蛋白融合蛋白乳糖操縱子的特性SDS初步分析實驗十重組DNA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達實驗?zāi)康膶嶒炘聿牧吓c試劑實驗儀器操作步驟注意事項實驗安排思考與討論實驗?zāi)康牧私夂驼莆誌PTG誘導(dǎo)表達的原理。了解降解物阻遏的現(xiàn)象及其機理。實驗原理操縱子是基因表達的協(xié)調(diào)單位。通常由2個以上功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及一些調(diào)節(jié)序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。乳糖操縱子由三個結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A和操縱序列、啟動子、CAP結(jié)合位點等調(diào)節(jié)序列組成。

乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達當(dāng)沒有乳糖存在時，調(diào)節(jié)基因lacI表達，轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱序列l(wèi)acO結(jié)合，阻礙了結(jié)合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動，使結(jié)構(gòu)基因不能轉(zhuǎn)錄，也就不能翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說，當(dāng)沒有乳糖存在時，乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài)。

乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達（續(xù)）當(dāng)有乳糖存在時，乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖，異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，而不能結(jié)合到操縱序列上，RNA聚合酶可以從啟動子向3’端移動，于是，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄出mRNA，然后翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說，當(dāng)有乳糖存在時，乳糖操縱子被誘導(dǎo)。乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖。IPTG是異乳糖的結(jié)構(gòu)類似物。由于IPTG不會被分解，它的誘導(dǎo)作用是持久的。

乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達（續(xù)）本實驗所使用的表達載體上含有乳糖操縱子的調(diào)節(jié)序列，目的基因為綠色熒光蛋白基因。在IPTG的誘導(dǎo)下，目的基因表達可增強105倍。然而，誘導(dǎo)表達常常受到溫度和誘導(dǎo)物的影響。乳糖操縱子的降解物阻遏當(dāng)細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長時，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有當(dāng)葡萄糖耗盡后，細菌才能充分利用乳糖，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng)，其實質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏（catabolicrepression）。乳糖操縱子的降解物阻遏（續(xù)）降解物阻遏的機理：代謝物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein，CAP），又稱cAMP受體蛋白（cAMPReceptorProtein，CRP）屬于激活蛋白的一種，對乳糖操縱子進行正調(diào)節(jié)。

CAP分子內(nèi)分別有DNA結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合區(qū)。當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后，就可結(jié)合到CAP結(jié)合位點上，促進轉(zhuǎn)錄。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制轉(zhuǎn)錄。阻遏蛋白負調(diào)節(jié)與CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào)當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒有CAP存在時，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性。只有在CAP存在且沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合時，或者說只有高乳糖低葡萄糖時，操縱子發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性。這種協(xié)調(diào)與細菌對碳源的優(yōu)先利用相一致。Thestructureoflacoperon調(diào)節(jié)序列結(jié)構(gòu)基因Repressorandnegativeregulation異乳糖異丙基硫代半乳糖苷異乳糖CAPandpositiveregulation低乳糖時高乳糖時在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)下，lacoperon的強誘導(dǎo)作用發(fā)生在高乳糖、低葡萄糖的狀態(tài)。材料與試劑材料含pUC18質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工程菌。試劑LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeastextract）5g、NaCl10g，加800mL雙蒸水溶解，用10MNaOH調(diào)pH至7.2-7.5，定容至1000mL。分裝，高壓滅菌，4℃保存。氨芐青霉素溶液：無菌雙蒸水配成100mg/mL，分裝，-20℃保存，使用終濃度為50μg/mL或100μg/mL。IPTG溶液：將238.3mgIPTG溶解于10mL雙蒸水，0.22μm細菌濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?，貯存濃度為100mM。20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水，定容至100mL，121℃，15min滅菌，4℃保存。實驗儀器超凈工作臺、恒溫搖床、離心機等。操作步驟挑取含pUC18質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工程菌單菌落，分別接種于含氨芐青霉（終濃度為100μg/mL，以下同)的5mL的LB培養(yǎng)基中，于37℃、250rpm過夜培養(yǎng)12h-14h至對數(shù)生長期。取3支已滅菌的大試管，分別加入5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，編號為1#，2#，3#，另取一個250mL的滅菌三角瓶，編號為6#，加入50mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液。1#：接50μL空載工程菌（含pUC18）過夜培養(yǎng)物，25-28℃培養(yǎng)10h-12h；2#：接50μL重組菌（含pGFPuv）過夜培養(yǎng)物，25-28℃培養(yǎng)10h-12h；3#：接50μL重組菌（含pGFPuv

）過夜培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)至O.D600約為0.5（約3h-4h)，然后加入20%葡萄糖50μL至終濃度為0.2%，及100mMIPTG5μL至終濃度為0.1mM，25-28℃培養(yǎng)8h-10h或過夜；

6#：接500μL重組菌（含pGFPuv）過夜培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)至O.D600約為0.5（約3h-4h)，然后只加入100mMIPTG50μL至終濃度為0.1mM，25-28℃培養(yǎng)8h-10h或過夜。4.收集菌體。分別將1#-3#全部培養(yǎng)物收集到三個7mL離心管中，編上相應(yīng)編號，離心棄上清；三角瓶培養(yǎng)的50mL菌液混勻后取5mL于7mL離心管中（編號為4#），離心，上清收集到另一個指管，編號為5#，其余的培養(yǎng)液用50mL離心管于5000rpm，4℃，離心10min，棄上清，菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破碎細胞或保存于－20℃?zhèn)溆茫ㄒ妼嶒炇?.于紫外燈下觀察1#-5#管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光，記錄觀察到的現(xiàn)象。注意：把1#和2#管置4℃保存。分別標(biāo)Sample1和Sample2。

1＃2＃3＃6＃pUC18pGFPuv挑取單菌落，接種于5mLLBA培養(yǎng)基中。37℃過夜培養(yǎng)。按1:100接種對照IPTG+GlcIPTG1＃2＃3＃6＃1＃2＃3＃4＃5＃25℃

-28℃培養(yǎng)過夜5000rpm離心，收菌體取5mL離心其余離心收菌體，提取蛋白注意事項本實驗的目的是比較該重組DNA在大腸桿菌中表達時受IPTG和葡萄糖存在的影響。在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及收菌時要注意各管編號要相應(yīng)對好，不能混亂。1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外還加入葡萄糖（濃度要大于0.2%以上）。6#瓶僅加IPTG。不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達量往往受到IPTG濃度和培養(yǎng)溫度的影響。在科研中一般都采用不同溫度或不同濃度的IPTG來誘導(dǎo)，以獲得最大的蛋白表達量。本實驗所表達的綠色熒光蛋白基因，其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強的熒光。離心后收集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色熒光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強弱，就可判斷其是否有表達及其所表達的強度。實驗安排第一天：上午配試劑，滅菌；下午開始接種，約3h-4h后開始誘導(dǎo)。（步驟2、3）第二天：收菌、紫外觀察結(jié)果和拍照；破碎細菌，分離上清，待過柱。思考與討論對紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。為什么誘導(dǎo)表達的大腸桿菌要在其OD600濃度約為0.5時加入IPTG？大腸桿菌的誘導(dǎo)表達常受哪些因素的影響？實驗十二金屬鰲合親和層析分離目的蛋白質(zhì)

實驗?zāi)康膶嶒炘聿牧吓c試劑實驗儀器操作步驟注意事項實驗安排思考與討論一．實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)親和層析的原理。掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作。實驗原理以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法稱為金屬螯合親和層析。蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。過渡金屬元素鎳在較低pH范圍時（pH6-8），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。在堿性pH時吸附更有效，但選擇性降低。金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。用IPTG誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽，這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進行分離，且操作簡單，快速，純化效率高。材料與試劑材料含pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達的細胞裂解蛋白。試劑0.05mol/LEDTA-0.5mol/LNaCl溶液50mL2mol/LNaCl

溶液50mL1mol/LNaOH溶液50mL0.2mol/LNiSO4溶液30mL起始緩沖液：50mmol/LTris-HCl;500mmol/LNaCl;pH7.0500mLChelatingSepharoseFastFlow4-5mL大腸桿菌細胞裂解蛋白樣品10-20mL洗滌液：50mmol/L咪唑；50mmol/LTris-HCl；0.5mol/LNaCl，pH7.0洗脫液：300mmol/L咪唑；50mmol/LTris-HCl；0.5mol/LNaCl，pH7.0

實驗儀器

1.5cmX50cm層析柱、自動分部收集器、紫外分光光度計、紫外檢測儀及記錄儀等。操作步驟樣品的制備:細胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達見實驗十，細胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25℃培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)液，5000r/min，離心10min，去上清液，菌體用起始緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細胞培養(yǎng)液）體積（15mL）的起始緩沖液充分懸浮，冰浴下進行超聲波處理，功率為400W，工作4秒，間隙4秒，為一次，99次為一周期。共處理六周期。然后8000r/min,離心30min，取上清液。放冰箱備用。親和層析柱的安裝把層析柱固定在鐵支架上，柱下端出口封閉。加入少量的無離子水，排去下端的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝膠4mL到燒杯中，加入少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進柱內(nèi)，打開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為4-5mL。親和凝膠的再生處理：用10倍柱體積的再生溶液（0.05mol/LEDTA、0.5mol/LNaCl）過柱，流速3mL/min。1drops/2s!用5倍柱體積的2mol/LNaCl

溶液洗親和層析柱除去多余的EDTA。流速3mL/min。用5倍柱體積的1mol/LNaOH溶液洗滌層析柱，流速2mL/min。用10倍柱體積的無離子水洗至pH8-9，流速3mL/min。用2倍柱體積的0.2mol/L的硫酸鎳溶液過層析柱，使凝膠金屬鎳離子結(jié)合,流速2mL/min。過完后放置5分鐘。用10倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子。流速3mL/min。用5倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。上樣：先從15mL裂解上清液中取出50μL準(zhǔn)備用于電泳，作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對照圖譜（Sample3）。然后以每分鐘1mL的流速上層析柱，分部收集流出液，每管3mL，（測得的OD280值曲線為穿流峰，取最高的一管樣品液用作電泳，標(biāo)Sample4）。再用10mL起始緩沖液過層析柱，操作同前。洗滌：用含50mmol/L咪唑的洗滌緩沖液25mL洗脫，分