核基因轉(zhuǎn)錄及加工

真核生物基因轉(zhuǎn)錄RogerD.Kornbergwasawardedthe2006NobelPrizeinChemistry"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription".真核生物基因轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：1.轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同類(lèi)型的RNA有不同的啟動(dòng)序列；

2.多種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄不同的RNA產(chǎn)物；3.多個(gè)調(diào)節(jié)因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；4.轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間和空間上分隔，轉(zhuǎn)錄后存在廣泛的加工。

1.RNA聚合酶啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性。RNAPolI:rRNA,相對(duì)活性50-70%RNAPolII:mRNA,相對(duì)活性20-40%miR-RNAPolIII:tRNA,相對(duì)活性10%RNAPolIV:smallncRNA,相對(duì)活性??真核生物三種RNA聚合酶的比較真核生物的啟動(dòng)子及其他特異DNA序列Sequenceelementswithinatypicaleukaryoticgene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301

basedonthethymidinekinasegeneoctamertranscriptionelementpromoterTATAbox(TATAAAA)

locatedapproximately25-30bpupstreamofthe+1startsite

determinestheexactstartsite(notinallpromoters)bindstheTATAbindingprotein(TBP)whichisasubunitofTFIIDGCbox(CCGCCC)bindsSp1(Specificityfactor1)CAATbox(GGCCAATCT)bindsCTF(CAATboxtf)Octamer(ATTTGCAT)bindsOTF(Octamertranscriptionfactor)+1ATTTGCATTSS核心元件區(qū)上游調(diào)控區(qū)基因調(diào)控區(qū)：由三部分組成核心元件區(qū)：——決定是否轉(zhuǎn)錄由TATAbox和起始位點(diǎn)（TSS）組成上游調(diào)控區(qū)UPE(UpstreamPromoterElement)

：具多種調(diào)控元件CAAT框、GC框等，含其中一種或多種，決定轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱（轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄起始頻率），啟動(dòng)子的強(qiáng)弱取決于UPE的類(lèi)型。確定真正的起始位點(diǎn)5SrRNA基因內(nèi)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)啟動(dòng)子有三種類(lèi)型：基因內(nèi)啟動(dòng)子基因外啟動(dòng)子混合啟動(dòng)子真核生物的特異DNA序列真核生物基因組中含有可以調(diào)控自身基因表達(dá)活性的特異DNA序列，稱(chēng)為順式作用元件(cis-actingelement)。

順式作用元件能夠被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白特異識(shí)別和結(jié)合，從而影響基因表達(dá)活性。啟動(dòng)子(promoter)

順式作用元件又分增強(qiáng)子(enhancer)沉默子(silencer)En/SiProDNA編碼序列轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)更上游；如β–珠蛋白基因的遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)在-1300—-3300間增強(qiáng)子：使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增強(qiáng)的DNA序列，作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)元件。特點(diǎn)：1.增強(qiáng)效應(yīng)明顯（10–200倍）；2.增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無(wú)關(guān)；

3.大多為重復(fù)序列，一般50bp；

4.增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性，只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能；5.沒(méi)有基因?qū)Ｒ恍?。作用機(jī)制：通過(guò)改變模板DNA的整體結(jié)構(gòu)（影響DNA-Pro復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或改變DNA超螺旋密度）eg.形成Z-DNA，增強(qiáng)子才有功能。一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激附近的任一啟動(dòng)子。GenecloneHACNS1增強(qiáng)子HACNS1（又叫CENTG2）是對(duì)進(jìn)化有貢獻(xiàn)的一個(gè)基因增強(qiáng)子。如今有證據(jù)顯示在人類(lèi)基因組發(fā)現(xiàn)的十一萬(wàn)基因增強(qiáng)子中HACNS1在人類(lèi)與祖先黑猩猩分道揚(yáng)鑣之后的進(jìn)化過(guò)程中變化最大，對(duì)人手指和可能改造腳踝以適應(yīng)人類(lèi)兩腿行走意義。14Typicalstructureofaneukaryoticgeneenhancerorsilencer5’UTR3’UTR3.真核基因的調(diào)節(jié)蛋白

反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或間接與順式作用元件相互作用，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類(lèi)調(diào)節(jié)蛋白，統(tǒng)稱(chēng)為反式作用因子。按其功能不同，常有以下三類(lèi)：

基本轉(zhuǎn)錄因子:識(shí)別promoter元件轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子:識(shí)別enhancer或silencer共調(diào)節(jié)因子：不能進(jìn)行DNA-蛋白質(zhì)相互作用RNA聚合酶Ⅱ在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物polⅡTFⅡHTAFTFⅡFTAFTAFTFⅡATFⅡBTBPTATADNATAF:TBPassociatedfactorsholoenzyme（1）基本轉(zhuǎn)錄因子(generaltranscriptionfactor)

是指能夠直接或間接與啟動(dòng)子核心序列TATA盒特異結(jié)合、并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一類(lèi)調(diào)節(jié)蛋白。TBP:TATA-boxbindingproteinTFII:polIIassociatedTF(2)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(transcriptionfactor,TF)

這類(lèi)調(diào)節(jié)蛋白能識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游序列和遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子元件，通過(guò)DNA－蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。決定不同基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá). 轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptionalactivator) 轉(zhuǎn)錄阻遏因子(transcriptionalrepressor)（3）共調(diào)節(jié)因子(transcriptionalregulator/co-factor)首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白－蛋白相互作用，進(jìn)而影響它們的分子構(gòu)象，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,本身無(wú)DNA結(jié)合活性。如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用——共激活因子；與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用——共阻遏因子。常見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域(domain)組成DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain)BasicAA(K/R)rich,positivelycharged轉(zhuǎn)錄激活域(trans-activationdomain)TF蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域（dimerization,co-factors）谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域(D/E-rich)脯氨酸(P)富含域最常見(jiàn)的DNAbindingdomain鋅指(zincfinger)C——CysH——His常結(jié)合GCbox典型的類(lèi)固醇激素受體(steroidhormonereceptor)結(jié)構(gòu)示意圖(2ZincfingersintheDBdomain)

堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活蛋白與調(diào)控區(qū)DNA相結(jié)合的示意圖

堿性亮氨酸拉鏈（bZIP:basicLeuZip)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活因子序列比較

K:lysine賴氨酸R:arginine精氨酸bHLH蛋白(basicHelix-Loop-Helix)同源域(Homeodomain)蛋白通過(guò)其第三個(gè)螺旋與雙鏈DNA的大溝相結(jié)合，其N(xiāo)端的延伸部分則與DNA的小溝相結(jié)合，提高了穩(wěn)定性

常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域

真核基因表達(dá)調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是復(fù)雜的、多樣的網(wǎng)絡(luò)*不同的DNA元件組合可產(chǎn)生多種類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式。*多種轉(zhuǎn)錄因子又可結(jié)合相同或不同的DNA元件。*轉(zhuǎn)錄因子與DNA元件結(jié)合后，對(duì)轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程所產(chǎn)生的效果各異，有正性調(diào)節(jié)或負(fù)性調(diào)節(jié)之分。真核基因表達(dá)的多級(jí)調(diào)控組蛋白修飾DNA甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄后加工mRNA降解蛋白質(zhì)降解蛋白質(zhì)翻譯翻譯后修飾1.染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)主要依賴于輔助調(diào)節(jié)因子對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。輔助調(diào)節(jié)子通過(guò)三種方式對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)起調(diào)節(jié)作用：1）依賴于ATP的核小體重建復(fù)合體（ADRC）：它們依靠水解ATP所產(chǎn)生的能量來(lái)改變核小體的相對(duì)位置，將DNA序列暴露出來(lái)，使轉(zhuǎn)錄因子能夠與之結(jié)合。這是一個(gè)物理過(guò)程，染色質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有變化，只改變核小體的相對(duì)位置。2）組蛋白修飾：主要通過(guò)共價(jià)修飾組蛋白的末端來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。當(dāng)構(gòu)成染色質(zhì)的組蛋白發(fā)生修飾時(shí)，就會(huì)影響染色質(zhì)的構(gòu)型，而結(jié)構(gòu)的變化引起基因轉(zhuǎn)錄活性的變化。3）DNA甲基化：真核DNA約有5%的胞嘧啶被甲基化。一般而言，DNA甲基化抑制基因表達(dá)。

組蛋白發(fā)生修飾，堿基暴露等原因而引起核小體結(jié)構(gòu)改變，使核小體不穩(wěn)定性增加。Sequence-independentlinkerhistones:controlDNAcompactionandaccessibilitytotrans-actingfactorspost-translationalmodificationsofhistonetails:controlcompactionofDNAandserveasdockingsitesfortrans-actingfactorsDNA甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用

甲基化預(yù)測(cè)在我們的基因組中，發(fā)生甲基化的DNA影響基因的開(kāi)關(guān)?；虮磉_(dá)能夠推斷與我們的身份相關(guān)聯(lián)的幾種屬性，如性別、種族、年齡和健康，甚至童年時(shí)代經(jīng)歷。FactorsunderlyingvariableDNAmethylationinahumancommunitycohort.LuciaL.Lama,etal.doi:10.1073/pnas.11212491092.DNA水平的調(diào)節(jié)

真核基因一般都處于阻遏狀態(tài)，RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力很低。通過(guò)利用各種轉(zhuǎn)錄因子正性激活RNA聚合酶是真核基因調(diào)控的主要機(jī)制。3.RNA水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工：真核基因大多為斷裂基因，內(nèi)含子和外顯子一起被轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物經(jīng)剪接（包括可變剪切,alternativesplicing）、加帽、加尾等加工修飾，才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA。RNA降解：包括非特異性降解（RNase,exosome)和特異性降解(NMD，RNAi)。4.蛋白水平的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成:ribosome蛋白翻譯，構(gòu)像折疊，細(xì)胞內(nèi)定位蛋白質(zhì)修飾:包括磷酸化(phosphorylation),乙?；?acetylation)，甲基化(methylation),糖基化(glycosylation),etc蛋白降解：包括非特異性降解（protease,peroxisome，vacuole)和特異性降解(Ubiquitin/proteasomesystem,下下次課具體講)。真核基因表達(dá)調(diào)控的主要步驟

染色質(zhì)去組裝蛋白質(zhì)修飾生化功能真核基因轉(zhuǎn)錄后的加工

1.真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特點(diǎn)：含內(nèi)含子，需經(jīng)剪接去除；需要修飾（加帽、加尾，稀有堿基）；轉(zhuǎn)錄和翻譯是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。

2.加工類(lèi)型:加帽、加尾修飾——甲基化、?；艚覴NA編輯RNA加工的意義：活化——使無(wú)活性的前體RNA加工成有活性的成熟RNA；（rRNA、tRNA的剪接、修飾）改變基因的編碼產(chǎn)物——同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，不同剪接方式，編輯方式，蛋白產(chǎn)物不同；調(diào)節(jié)方式——加工會(huì)影響RNA的活性、半衰期、運(yùn)輸?shù)?，影響RNA功能的發(fā)揮；編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因在核漿中被轉(zhuǎn)錄，RNA分子很大，且很不穩(wěn)定，由于大小很不一致，稱(chēng)為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA），其中mRNA是由hnRNA加工成的。hnRNA25%——mRNA75%——在核內(nèi)降解hnRNA先加帽，hnRNA尾端被切去一段后，加poly（A）尾，切除內(nèi)含子成為mRNA，進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)。加帽(Cap0、CapI、CapII三種帽子結(jié)構(gòu))在細(xì)胞核中進(jìn)行，hnRNA的5’端常為GTP，帽子化過(guò)程后，形成m7G5’ppp5’Np結(jié)構(gòu)。5’帽子的功能：

保護(hù)mRNA免受5’-核酸外切酶降解；

使mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；

對(duì)翻譯起識(shí)別作用（m7G5’ppp5’Np優(yōu)先與核糖體結(jié)合）。三種帽結(jié)構(gòu)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的切除與多聚腺苷酸化RNAsplicingandediting剪接splicing——把斷裂基因轉(zhuǎn)錄本中的內(nèi)含子除去

真核生物基因是斷裂基因(splitgene)

外顯子(exon)與內(nèi)含子(intron)Alternativepromoters&RNAsplicing-essentiallydisprovedtheoldernotionthatasinglegenesequenceencodedasingleprotein圖8-9可變剪接導(dǎo)致α-淀粉酶基因在不同組織中的表達(dá)差異

內(nèi)含子的剪接方式

自我剪接（由RNA分子本身完成）：Ⅰ型Ⅱ型剪接體SnRNP參與——mRNA

酶蛋白參與的剪接——tRNASnRNA參與的mRNA前體的剪接自我剪接與剪接體催化的剪接比較InhibitionofRNAHelicaseBrr2bytheC-TerminalTailoftheSpliceosomalProteinPrp8.Science,May232013;DOI:10.1126/science.1237515mRNA的不同剪接產(chǎn)物在某些生物中，在不同分化時(shí)期，RNA種