基于rapd-pcr技術(shù)的福建山藥資源遺傳多樣性分析

基于rapd-pcr技術(shù)的福建山藥資源遺傳多樣性分析

山藥又名“甘薯”，是一種一級(jí)或二級(jí)植物。產(chǎn)于中國福建、廣東、臺(tái)灣等省和東南亞。這是藥食資源和食品資源的重要資源?！侗静菥V目》將其功效概括為“益腎氣,健脾胃,止泄痢,代痰涎”。但長期以來,生產(chǎn)上和市場上存在同名異種或同種異名的現(xiàn)象,嚴(yán)重干擾了山藥種質(zhì)資源的推廣與開發(fā)。福建省作為山藥的原產(chǎn)地之一,研究山藥資源的遺傳多樣性對引種育種、資源改良、資源鑒定和生產(chǎn)加工等均有重要意義。RAPD分子標(biāo)記是植物DNA水平上遺傳多樣性的直接反映,與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記相比,具有多態(tài)性豐富,不受環(huán)境因子影響等優(yōu)點(diǎn)。已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系研究,遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性評價(jià)等領(lǐng)域。在國外,已有利用同工酶、RAPD、RFLP、AFLP和SSR等技術(shù)研究山藥的遺傳連鎖圖譜、種質(zhì)鑒定和野山藥的微衛(wèi)星多態(tài)性等方面的報(bào)道。在國內(nèi),周延清等利用ISSR標(biāo)記分析了山藥品種的遺傳多樣性,李明軍等對山藥基因組DNA的提取及RAPD反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,但利用RAPD技術(shù)對山藥遺傳多樣性的研究尚未見報(bào)道。因此,本研究采用RAPD技術(shù)研究了福建山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性,可為山藥引種育種、生產(chǎn)加工、資源研究及保護(hù)提供可靠依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1山藥資源供試材料為三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所牧草課題組提供的34份來自福建不同地區(qū)的山藥資源(表1)。1.1.2pcr和rapd試劑TaqDNA聚合酶、dNTP(2.5mmol/Leach)、10×PCRbuffer等PCR試劑均購自TaKaRa公司(大連),RAPD隨機(jī)引物購自上海生物工程有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純生化試劑。1.2方法1.2.1提取的胎盤dna采用CTAB法提取山藥幼葉基因組DNA。1.2.2酶活劑的篩選試驗(yàn)在參考已有山藥、煙草RAPD反應(yīng)體系和其他植物RAPD反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上,進(jìn)行20μl反應(yīng)體系的四因素不同水平(濃度梯度)的優(yōu)化篩選試驗(yàn)(表2)。當(dāng)其中某一因素濃度變化時(shí),其他因素保持在已篩出的最優(yōu)水平上。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,37℃退火30s,72℃延伸90s,40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。1.2.3引用試劑篩選根據(jù)RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果,以閩薯28號(hào)的DNA為材料對200多條RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行篩選。1.2.4材料相似系數(shù)計(jì)算每條電泳譜帶被視為一個(gè)分子標(biāo)記,按同一位置上的DNA帶的有無統(tǒng)計(jì),有條帶的賦值1,無條帶的賦值0。對34份資源隨機(jī)擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以1、0矩陣輸入電腦。根據(jù)唐啟義等的DPS數(shù)據(jù)處理軟件中的Nei-Li相似系數(shù)法求得材料i和j之間的相似系數(shù)Sij:Sij=2Nij/(Ni+Nj)其中Ni表示材料i中的條帶數(shù)目,Nj表示材料j的條帶數(shù)目,Nij表示材料i和材料j共有的條帶數(shù)目。然后用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)對其進(jìn)行聚類分析。2結(jié)果與分析2.1rad反應(yīng)體系的建立2.1.1l體系模板dna加入量的確定圖1為不同濃度模板DNA對RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響。從圖1可以看出,20μl體系模板DNA的加入量對擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果影響不大,均能獲得較理想的擴(kuò)增效果,并且擴(kuò)增產(chǎn)物帶型清楚,因此本實(shí)驗(yàn)選擇20ngDNA作為模板DNA的加入量。2.1.2taqcda聚合酶用量對rapd-pcr反應(yīng)結(jié)果的影響從圖2可以看出,TaqDNA聚合酶的不同濃度對RAPD-PCR反應(yīng)結(jié)果差異較明顯,TaqDNA聚合酶用量在1.5U時(shí)效果最好,因此,TaqDNA聚合酶用量以1.5U為宜。2.1.3dntp用量的確定圖3為不同dNTP濃度對山藥RAPD-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響。當(dāng)dNTP的加入量為0.1mmol/L、0.16mmol/L、0.19mmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出清晰條帶,本實(shí)驗(yàn)選擇0.1mmol/L的dNTP作為適宜加入量。2.1.4引物濃度對條帶的影響引物濃度的變化對山藥RAPD反應(yīng)結(jié)果存在影響。從圖4中可以看出,當(dāng)引物濃度過低時(shí),條帶模糊,甚至擴(kuò)增不出條帶。當(dāng)引物濃度在20pmol/L(4泳道)時(shí),擴(kuò)增效果最理想。2.2分子標(biāo)記的篩選以閩薯28號(hào)作為模板DNA對200多條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選,共選出多態(tài)性高、條帶清晰、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的24條引物用于進(jìn)一步的分子標(biāo)記研究。其引物編號(hào)、序列和篩選出的引物擴(kuò)增帶型見表3和圖5。2.3山藥材料基因組dna電泳結(jié)果將篩選出的24條隨機(jī)引物對供試的34份山藥材料進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后得到山藥材料基因組DNA的指紋圖譜,圖6、7是引物AD-01和G-17的電泳結(jié)果。24條隨機(jī)引物共擴(kuò)增到182條條帶,其中多態(tài)性條帶161條,多態(tài)性比率為88.5%,表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。2.4遺傳相似系數(shù)根據(jù)RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果,采取DPS軟件統(tǒng)計(jì)了34份山藥資源之間的遺傳相似系數(shù),用UPGMA(unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmean)法對其進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖8所示。34份山藥資源的遺傳相似系數(shù)在0.60～0.95之間,表現(xiàn)出豐富的多樣性。其中,閩薯22號(hào)和閩薯23號(hào)的相似系數(shù)最大,為0.95,表明它們之間親緣關(guān)系較近;閩薯22號(hào)與閩薯29號(hào)的相似系數(shù)最小,為0.60,表明它們之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.66時(shí),可將34份資源分成4類:第I類為普通山藥,包括閩薯1號(hào)、閩薯4號(hào)、閩薯28號(hào)和閩薯31號(hào)等28份資源;第II類為扁山藥,只有閩薯14號(hào)1份資源;第III類為福建大薯,包含閩薯26號(hào)1份資源;第IV類為田薯(參薯),包括閩薯29號(hào)、閩薯34號(hào)、閩薯32號(hào)和閩薯33號(hào)4份資源。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí),又可將第I類普通山藥分為棒山藥和長山藥2個(gè)亞類,其中棒山藥包含閩薯1號(hào)、閩薯4號(hào)、閩薯13號(hào)和閩薯30號(hào)等22份資源;長山藥含閩薯2號(hào)、閩薯28號(hào)和閩薯31號(hào)等6份資源。這與蔡金輝等經(jīng)典的園藝學(xué)分類基本上相符,從而在分子水平上支持了按園藝學(xué)薯塊類型進(jìn)行山藥資源分類的觀點(diǎn)。3rapd擴(kuò)增條件篩選RAPD技術(shù)對DNA質(zhì)量要求不高,操作簡單方便。但許多因素會(huì)影響RAPD的穩(wěn)定性與重復(fù)性,如模板DNA、dNTP、Taq酶、引物濃度等。本實(shí)驗(yàn)?zāi)０錎NA在10～80ng之間對擴(kuò)增結(jié)果沒有明顯差異,故本實(shí)驗(yàn)確定的用量為20ng。RAPD反應(yīng)中dNTP常用濃度為0.1～0.2mmol/L,濃度太低則產(chǎn)率低,太高易發(fā)生錯(cuò)配,本研究中用0.1mmol/L就能得到良好效果。而李明軍等研究指出山藥模板DNA和dNTP最佳量為200ng和0.25mmol/L,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大。在TaqDNA聚合酶濃度梯度實(shí)驗(yàn)中,1U酶用量能夠得到理想結(jié)果,但在實(shí)際擴(kuò)增中酶用量要達(dá)到1.5U才能得到較好結(jié)果,說明單個(gè)因素篩選最佳結(jié)果的組合并不一定是最佳反應(yīng)體系。同時(shí)本研究采用了李明軍等篩選出的5條隨機(jī)引物對山藥資源進(jìn)行RAPD-PCR分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有OPC-11和OPB-5擴(kuò)增出較好結(jié)果,其余3條引物均未擴(kuò)增出條帶,說明RAPD重復(fù)性跟反應(yīng)條件有很大關(guān)系。34份樣本在遺傳相似系數(shù)為0.66時(shí),分為4類,閩薯14號(hào)和閩薯26號(hào)各自成為一類。閩薯14號(hào)自成一類的原因可能有兩種:一是閩薯14號(hào)為扁山藥,從薯塊大小上應(yīng)屬于普通山藥,但其形狀為扁狀或佛掌狀,而普通山藥都為圓柱狀,這與過去籠統(tǒng)地將山藥分為長形、扁形、塊狀3種類型相吻合。前人對山藥的分類,較統(tǒng)一的看法是將我國栽培的山藥分為普通山藥和田薯兩個(gè)種,有的是在每個(gè)種以下,分別分出長柱種、扁塊種與圓筒種3種;有的則將普通山藥分為長山藥、棒山藥和佛掌薯3個(gè)變種。后兩者均認(rèn)為扁山藥是普通山藥下的一個(gè)變種,與本研究結(jié)果不同。二是閩薯14號(hào)極其抗寒,經(jīng)2007年春節(jié)前后的雨雪霜凍后的地下薯塊仍能作為2008年春季種用薯塊,且其地上部仍有綠葉,其余的33份材料的地上部均在12月前枯黃。在用引物A-20擴(kuò)增時(shí),閩薯14號(hào)得到