熒光分光光度計(jì)課件

2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)1光學(xué)分析儀器（2）熒光分光度計(jì)的原理與應(yīng)用技術(shù)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)2熒光分光光度法

光的基本性質(zhì)光是一定波段范圍的電磁波，具有波粒二象性。光的波動(dòng)性可用波長(zhǎng)

、頻率

、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來(lái)描述：

=c

；波數(shù)=1/

=

/c

光的粒子性說(shuō)明光是有能量的：

E=h=hc/

（Planck常數(shù)：h=6.626×10-34J×S)1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)3熒光分光光度法

光學(xué)分析儀器主要是通過(guò)電磁波與物質(zhì)互作用后，物質(zhì)對(duì)電磁輻射產(chǎn)生吸收或再發(fā)射，測(cè)量所得到的信息來(lái)對(duì)物質(zhì)加以研究的分析儀器。這方面的儀器很多，在這里我們主要對(duì)紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)和熒光分光光讀計(jì)加以討論。1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)4熒光分光光度法光學(xué)分析儀器

因?yàn)槲镔|(zhì)對(duì)光的選擇性吸收的特點(diǎn)，他的吸收有如下的特性M+h

M*M+熱

基態(tài)激發(fā)態(tài)M+熒光或磷光1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)5

熒光分光光度法

原子發(fā)射光譜法：原子熒光分析

發(fā)射光譜法

分子發(fā)射光譜法：熒光分析、磷光分析

光譜分析法

原子吸收光譜法：原子吸收分光分析

吸收光譜法

分子吸收光譜發(fā)：紫外可見(jiàn)、紅外吸收光譜

1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)6熒光分光光度法

熒光分光光度法

熒光現(xiàn)象早在16世紀(jì)就比發(fā)現(xiàn)，但對(duì)熒光產(chǎn)生的原理和條件直到19世紀(jì)才基本清楚。Stokes在1852年考察了奎寧和葉綠素的熒光后發(fā)現(xiàn)，他們的熒光波長(zhǎng)要比照射的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。認(rèn)定是物質(zhì)吸收光能后重新發(fā)射的光，并且波長(zhǎng)不同，熒光是發(fā)射光才被證實(shí)。

1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)7熒光分光光度法熒光分光光度法

當(dāng)用紫外光照射某種物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)出各種顏色和不同強(qiáng)度的光，當(dāng)紫外光停止照射時(shí)，這種光線也隨之消失。我們這種光線稱(chēng)為熒光。依據(jù)物質(zhì)所發(fā)熒光的顏色和強(qiáng)度建立起來(lái)的定性和定量的分析方法稱(chēng)為熒光分光光度法。

1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)8熒光分光光度法熒光的產(chǎn)生：熒光是一種自然現(xiàn)象，在我們的日常生活中到處可以看見(jiàn)。產(chǎn)生熒光的原因是：熒光物質(zhì)分子吸收了特征頻率的能量后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后內(nèi)能轉(zhuǎn)換消耗部分能量，返回到最低電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再?gòu)倪@個(gè)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)所發(fā)的光，這束光我們稱(chēng)為熒光。熒光發(fā)射的能量要比吸收光的能量?。úㄩL(zhǎng)要長(zhǎng)）。在這里我們用分子能級(jí)圖就能夠很好的理解它的產(chǎn)生過(guò)程。

1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)9熒光分光光度法分子能級(jí)圖：

1、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)10熒光分光光度法

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

F-7000熒光分光光度計(jì)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)11熒光分光光度法熒光分析儀器的結(jié)構(gòu)和主要部件：

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)12熒光分光光度法

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.1、光源：對(duì)光源的要求是必須有足夠的強(qiáng)度且具有連續(xù)光譜，其波長(zhǎng)范圍能滿足儀器的需要。大部分儀器由氙燈組成,它對(duì)能量的要求沒(méi)有紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)那么嚴(yán)格。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)13熒光分光光度法氙燈光源

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)波長(zhǎng)范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動(dòng)電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)14熒光分光光度法

2、熒光分光光度法簡(jiǎn)介2.2、單色器：色器也是熒光分光度計(jì)的核心部件。它有兩個(gè)單色器。激發(fā)單色器它的作用是將光源發(fā)出的白色光色散成各種波長(zhǎng)的單色光用于照射樣品，發(fā)射單色器的作用只讓樣品發(fā)出的熒光通過(guò)。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)15熒光分光光度法

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.3、樣品室樣品室比較寬大，以容納各種光徑的樣品池和附件。如流動(dòng)池，微量池等。樣品池全用石英材料制成，沒(méi)有玻璃樣品池。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)16熒光分光光度法

F-7000熒光分光光度計(jì)樣品室2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)17熒光分光光度法

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)18熒光分光光度法

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.4、檢測(cè)器熒光分光光度計(jì)常用的是光電檢測(cè)器。如光電池、光電管、光電倍增管和二極管陣列檢測(cè)器?，F(xiàn)在大部分是光電管2.5、數(shù)據(jù)測(cè)量和控制：

控制儀器，并把測(cè)量到的熒光強(qiáng)度顯示出來(lái)。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)19熒光分光光度法

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2.3、樣品室樣品室比較寬大，以容納各種光徑的樣品池和附件。如流動(dòng)池，微量池等。樣品池全用石英材料制成，沒(méi)有玻璃樣品池。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)20熒光分光光度法熒光分光光度計(jì)于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的區(qū)別

2、熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)21熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.1、特點(diǎn)有以下幾點(diǎn)：（1）靈敏度高熒光分析的最大特點(diǎn)是靈敏度高，通常比紫外可見(jiàn)光度計(jì)高出2—3個(gè)數(shù)量級(jí)。（2）選擇性強(qiáng)熒光光譜包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。因此確定恰當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光譜和發(fā)射波長(zhǎng)，能達(dá)到很高的選擇。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)22熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)

（3）試樣量少和方法簡(jiǎn)單由于熒光分析法靈敏度高，因而分析時(shí)需試樣量較小。特別在使用微量池時(shí)，用樣量可以大大減小。（4）能獲得更多的信息熒光分析可提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、總熒光量、峰位、譜帶寬度、量子產(chǎn)率、熒光壽命等參數(shù)。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)23熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)

（5）受外界影響較大，外界因素如溫度、PH值、溶劑和其它因素都可能顯著地影響分析結(jié)果。其中溫度對(duì)他的影響最大，這也是熒光分析需標(biāo)準(zhǔn)的原因。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)24熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.2、熒光分光光度法的發(fā)展近年來(lái)，熒光分光度計(jì)隨著新技術(shù)的的采用，發(fā)展非?？?，特別是計(jì)算機(jī)和其它先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用的引入，是熒光光度計(jì)發(fā)生了根本的變化，相應(yīng)的分析方法也得到很快的發(fā)展，象激光熒光分析技術(shù)、時(shí)間分辨熒光分光光度法、同步熒光分析法，這些又大的推動(dòng)了分析方法在理論和應(yīng)用方面的進(jìn)展。同時(shí)促進(jìn)熒光分析技術(shù)的不斷完善。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)25熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系是個(gè)比較重要而復(fù)雜的問(wèn)題，但是，由于對(duì)激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解得不多，所以對(duì)他們的關(guān)系還不十分清楚。一般來(lái)說(shuō)，能發(fā)出熒光的物質(zhì)具有較大的吸收光能力、較高的熒光量子效率和合適的環(huán)境。分子中含有能發(fā)熒光的基團(tuán)稱(chēng)為熒光團(tuán)。對(duì)于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)之間關(guān)系的描述可簡(jiǎn)單的總結(jié)以下幾點(diǎn)，僅供參考。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)26熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

3.3.1、有機(jī)物的熒光（1）共軛效應(yīng)：具有共軛雙鍵的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，其電子共軛程度越大，越容易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，發(fā)光峰紅移程度越大,發(fā)光也越強(qiáng)。同一共軛環(huán)數(shù)的芳族化合物，線性環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光波長(zhǎng)比非線性者要長(zhǎng)。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)27熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

（2）鰲合物中配位體的發(fā)光：不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性的分子不處于同一平面，因而不發(fā)熒光。若這些化合物和金屬離子形成鰲合物，隨著分子的剛性增加，平面結(jié)構(gòu)增大，常常會(huì)發(fā)熒光。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)28熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

（3）剛性結(jié)構(gòu)和平面結(jié)構(gòu)效應(yīng)：一般來(lái)說(shuō)，熒光物質(zhì)的剛性和平面性增強(qiáng)，可使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減小，既使外轉(zhuǎn)移能量損失減小，從而有利于熒光的發(fā)射。如果分子內(nèi)取代基之間形成氫鍵，加強(qiáng)了分子的剛性結(jié)構(gòu)，其熒光強(qiáng)度將增加。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)29熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

取代基的類(lèi)型和位置：取代基對(duì)熒光體的影響分為加強(qiáng)熒光的、減弱熒光的和影響不明顯的。加強(qiáng)熒光的取代基有—OH—ORR—NH2—CN、—NHR、—NR2、—OCH3等給電子取代基，由于它們n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上的π軌道平行，因而共享了功軛電子結(jié)構(gòu)，同時(shí)，擴(kuò)大了共軛雙鍵體系。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)30熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

減弱熒光的有—COOH、—NO2、—NO、—SH等得電子取代基，它們n電子的電子云并不與芳環(huán)上π電子平面。影響不明顯的取代基有—NH3、—R、—SO3H等。（4）電子躍遷類(lèi)型：含有氮、氧、硫雜原子的有機(jī)物，它們的熒光強(qiáng)度與電子躍遷類(lèi)型有關(guān)。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)31熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

3.3.2、金屬鰲合物的熒光：除過(guò)元素的順磁性原子會(huì)發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類(lèi)金屬離子在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。但是,在某些條件下，金屬鰲合物卻能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬離子的測(cè)定。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)32熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

（1）鰲合物中配位體的發(fā)光：不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性的分子不處于同一平面，因而不發(fā)熒光。若這些化合物和金屬離子形成鰲合物，隨著分子的剛性增加，平面結(jié)構(gòu)增大，常常會(huì)發(fā)熒光。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)33熒光分光光度法

3、熒光分光光度法的特點(diǎn)3.3、熒光和分子的關(guān)系：

（2）鰲合物中金屬離子的特征光譜：π這類(lèi)發(fā)光過(guò)程通常是鰲合物首先通過(guò)配位體的π→π*躍遷而被激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)移給金屬離子，導(dǎo)致d→d*或f→f*路遷，最終發(fā)射的是d*→d或f*→f路遷光譜。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)34熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)4.1、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是用熒光分析法進(jìn)行定量和定性分析是的基本參數(shù)和依據(jù)。因次我們?cè)趯W(xué)習(xí)熒光分光光度法時(shí)要對(duì)它加以了解。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)35熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.1.1、激發(fā)光譜:將樣品放入光路中選擇合適的發(fā)射單色器的波長(zhǎng)和帶寬并使之固定不變，讓激發(fā)單色器的波長(zhǎng)掃描，所得的圖譜既為激發(fā)光譜。它反映了物質(zhì)的熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)36熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.1.1、激發(fā)光譜:

Fλ激發(fā)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)37熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.1.1、激發(fā)光譜:它的特性：激發(fā)光譜從理論上講同一物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大吸收波長(zhǎng)一致，但由于熒光測(cè)量?jī)x器的特性如光源的分布、單色器的透射和檢測(cè)器響應(yīng)的影響，實(shí)際測(cè)量的熒光激發(fā)光譜與吸收光譜不完全一致。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)38熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）：將熒光樣品放入光路中后，選擇合適的激發(fā)單色器波長(zhǎng)與帶寬使之固定不變，讓發(fā)射單色器的波長(zhǎng)掃描圖譜，所得光譜既為發(fā)射光譜。它反映了物質(zhì)的熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)39熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）：FΛ發(fā)射2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)40熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.1.2、發(fā)射光譜（也叫熒光光譜）：熒光光譜通常具有如下特性；（1）斯托克斯位移；（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；（3）熒光光譜與吸收光譜的鏡像關(guān)系。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)41熒光分光光度法分子能級(jí)圖：

4、熒光分析中常用參數(shù)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)42熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.2

熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度是表示發(fā)射相對(duì)強(qiáng)度的物理量，它是最常用的熒光參數(shù)之一。目前一般的商品儀器都采用熒光強(qiáng)度來(lái)表示，所以單位為任意單位，表示的是相對(duì)強(qiáng)度。2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)43熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.2

熒光強(qiáng)度物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度與它吸收的光能成正比，當(dāng)測(cè)量的溶液很稀時(shí)，可用如下公式表示：

F=KI0CLεф2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)44熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)4.2

熒光強(qiáng)度

F=KI0CLεф

F----熒光強(qiáng)度K----儀器常數(shù)I0---激發(fā)光強(qiáng)度C----樣品濃度L----池的光徑長(zhǎng)度ε----樣品消光系數(shù)ф----樣品的量子產(chǎn)率

2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)45熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.3、量子產(chǎn)率：因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度只是相對(duì)強(qiáng)度，只能在同一儀器相同條件下加以比較，所以要想比較不同物質(zhì)的熒光強(qiáng)弱，應(yīng)當(dāng)用量子產(chǎn)率來(lái)表示。量子產(chǎn)率=發(fā)射量子數(shù)/吸收量子數(shù)2023/9/28光學(xué)分析儀器培訓(xùn)46熒光分光光度法

4、熒光分析中常用參數(shù)

4.4、熒光的熄滅廣義的講,指任何可使某種