蛋白質研究技術

蛋白質研究技術一、蛋白質的理化性質蛋白質的膠體性質蛋白質的兩性電離蛋白質分子顆粒大小1~100nm之間,屬膠體顆粒范圍蛋白質的膠體原因：

表面形成水化層

表面同種電荷的斥力

蛋白質的膠體性質

在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體

當破壞了維持蛋白質膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質的構象時，蛋白質就會從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的沉淀(一)蛋白質的沉淀概念:

應用:(1)

蛋白質分離純化

(2)解毒

(3)臨床檢驗

蛋白質膠體性質與蛋白質沉淀1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）；2、酸堿（等電點沉淀）；3、有機溶劑沉淀；4、重金屬鹽類沉淀；5、生物堿試劑沉淀6、加熱變性沉淀(1)鹽析法(saltingout)

常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等

使蛋白質沉淀的方法

概念：向蛋白質溶液中加入大量中性鹽使蛋白質沉淀稱為鹽析

特點：不破壞蛋白質的構象，蛋白質不發(fā)生變性

作用原理:

鹽離子與水親和力極強，奪去蛋白質的水化層，減少分子間靜電斥力(2)有機溶劑沉淀法

注意事項:

必須在低溫下操作盡量縮短處理的時間及時將蛋白質中殘存的有機溶劑除去

缺點：常會使蛋白質變性常會使蛋白質變性原理:

使蛋白質脫去水化層,又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質表面電荷減少，導致蛋白質分子聚集而沉淀

常用有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮

(3)重金屬鹽沉淀法

若溶液pH大于蛋白質的pI，沉淀更易發(fā)生

缺點：此法常使蛋白質變性失活

原理:

重金屬離子如Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+

等帶有正電荷，能與蛋白質分子中帶負電的基團結合，生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀(4)生物堿試劑和某些酸類沉淀法

缺點：常引起蛋白質變性

原理:

生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等)，某些酸類(主要是指三氯醋酸、磺酰水楊酸和硝酸等)，與帶正電的蛋白質結合生成不溶性的鹽而沉淀注意事項:

反應溶液的pH<pI，確保蛋白質以陽離子形式存在

等電點沉淀：pH=pI時引起蛋白質的沉淀(二)蛋白質的凝固概念：變性蛋白質互相凝聚或互相穿插在一起的現(xiàn)象稱蛋白質的凝固，凝固作用本質上是蛋白質變性后進一步發(fā)展的不可逆結果如加熱可使蛋白質變?yōu)椴荒茉偃芙獾哪龎K超濾：利用壓力或離心力強行使水和小分子雜質通過超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質留在膜上，稱為超過濾透析：將蛋白質溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流動的適當?shù)木彌_液（如純水）中，小分子雜質（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出，而蛋白質保留于袋中從而將蛋白質純化（三）透析和超濾透析工作圖半透膜原理磁力攪拌器透析袋超濾工作圖(四)電泳

概念：帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相反方向移動的現(xiàn)象原理：不同的蛋白質的因結構、形狀和帶電量的不同而有不同的泳動速度，從而達到分析和分離蛋白質的目的應用：電泳技術是生化常用分析技術之一

(四)電泳

分類：自由界面電泳：蛋白質溶于緩沖液中進行電泳區(qū)帶電泳：將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上進

行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域

-紙電泳：用濾紙作為支持物

-凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物

圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳

平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進行的電泳

+

——+圓盤電泳平板電泳(四)電泳

電泳的應用：蛋白質分子量的測定：SDS,Native蛋白質等電點的測定：

IsoelectricFocusing

蛋白質組學研究：雙向電泳

樣品處理染色電泳蛋白質分子量的測定（SDS

）(四)電泳

(四)電泳

蛋白質等電點的測定等電聚焦第二相電泳染色

主要用于蛋白質組學研究蛋白質雙向電泳(2D)(四)電泳

(五)層析原理：溶質在互不相溶的兩相之間分配行為存在差別，從而導致移動速度的不同

離子交換色譜(ionexchangechromatography)

疏水作用色譜(hydrophobicchromatography)

凝膠過濾色譜(gelfiltrationchromatography)

親和色譜(affinitychromatography)

金屬螯和色譜(metalchelatingchromatography)

離子交換色譜原理：根據(jù)離子交換樹脂對各種離子的親和力不同而達到分離的目的，大分子因與樹脂親和力不同，以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強度或(和)pH使大分子從樹脂上先后被洗脫

分為：陰離子交換基：DEAE（二乙胺乙基）

QAE（季銨乙基）

陽離子交換基：

CM（羧甲基）

P（磷酸基）

SP（磺丙基）實驗條件的選擇2468101214等電點-體系

pH蛋白質帶負電荷+蛋白質帶正電荷

根據(jù)蛋白的性質選擇適宜的pH值和緩沖體系0實驗條件的選擇P+P0P-P2-P3-P3-P2-P-P+P0P3-P2-P-P+P0

根據(jù)蛋白的性質選擇合適的洗脫條件疏水作用色譜原理：根據(jù)蛋白質與吸附劑之間的弱疏水性作用的差別進行蛋白質的分步洗脫各種凝膠過濾介質經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑常用的疏水性配基：苯基、短鏈烷基C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚疏水吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應根據(jù)配基的疏水性而異，過小則疏水性吸附作用不足，過大則洗脫困難

疏水作用色譜的洗脫一般采用降低緩沖液中的鹽濃度來洗脫蛋白也可以采用加入少量的有機溶劑來洗脫，如反相色譜疏水作用色譜Fraction凝膠過濾色譜概念：

當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術，又可稱作排阻色譜或者分子篩色譜原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠（Sepharose）凝膠過濾色譜的洗脫凝膠過濾色譜的應用生物大分子的分離純化分子量的測定分級分離溶液濃縮平衡常數(shù)的測定細胞及顆粒的分離親和色譜原理：利用化學方法將可與待分離物質可逆性特異結合的化合物（稱配體）連接到固相載體上，當待提純的生物大分子通過此層析柱時，可以與載體上的配體特異的結合而留在柱上，其他物質則不能結合，然后用適當方法使生物大分子從配體上洗脫下來，從而達到分離提純的目的

特點：純化效率高，提純度可達幾千倍配體蛋白質蛋白質和配體復合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質雜質游離配體洗脫結合耦聯(lián)作用機理親和色譜的洗脫親和色譜的應用

抗原和抗體

激素和受體蛋白

凝集素和多糖(糖蛋白)

酶與輔酶(或產(chǎn)物、抑制劑)

核酸與互補鏈（或核酸多聚酶、結合蛋白）

細胞與細胞表面特異蛋白（或凝集素）金屬螯合色譜原理：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進行分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein特點：體系復雜:含量低、組分多、干擾大水溶液體系：接近生理狀態(tài)，盡量避免使用有機溶劑低溫操作：防止蛋白變性和失活必要的添加劑：蛋白酶抑制劑、還原劑專業(yè)的儀器設備：制備型蛋白質分離、純化和鑒定蛋白質分離、純化和鑒定蛋白質分離提純的原則：

純度、活性和產(chǎn)量蛋白質分離提純的一般步驟：

破碎細胞→蛋白提取→粗細分級→鑒定分離純化技術

綜合運用各種方法和技術蛋白質分離純化方法按蛋白質性質分類

溶解度：沉淀(鹽析、有機溶劑、等電點)

分子大小、形狀：離心、超濾、透析、凝膠過濾層析