常用生物化學(xué)檢驗技術(shù)一

1臨床生物化學(xué)檢驗常用技術(shù)

阿克蘇地區(qū)第二人民醫(yī)院王霞第三章2第一節(jié)光譜分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)第四節(jié)電泳技術(shù)第五節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)

本章內(nèi)容概要3教學(xué)目標(biāo)和要求1、掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。掌握電化學(xué)分析方法基本原理2、熟悉分光光度計的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查和波長校正、原子分光光度計的類型和影響熒光分析的因素。熟悉離子選擇電極分類，離子選擇電極的分析方法3、了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗中的應(yīng)用。4第一節(jié)光譜分析技術(shù)分光光度技術(shù)的基本原理分光光度計的基本結(jié)構(gòu)分光光度計的操作方法分光光度技術(shù)的定性和定量方法5一、光譜分析技術(shù)的基本原理：

利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。1、光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法

吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光度法和紅外光譜法

散射光譜分析技術(shù)：比濁法

6微粒性(E=hv)

波粒二象性波動性(

=c/v)E=hv=hc/

----光的能量與光的波長成反比，與光的頻率成正比2、光的基本性質(zhì)---高速傳播的電磁波73、物質(zhì)對光吸收的基本原理：能量轉(zhuǎn)移

----當(dāng)光輻射通過某種物質(zhì)時，組成該物質(zhì)的分子（原子）與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量因此轉(zhuǎn)移至分子（原子）上，使它們由基態(tài)(低能態(tài))躍遷到激發(fā)態(tài)(高能態(tài))，這種躍遷稱為激發(fā)。8選擇吸收

----組成物質(zhì)的分子僅吸收與其內(nèi)能變化(基態(tài)與激發(fā)態(tài)能量差)相對應(yīng)的波長或頻率的光，所得到的光譜稱為吸收光譜。

9能量釋放

----處于較高能態(tài)的分子(激發(fā)態(tài)分子)不穩(wěn)定，當(dāng)其返回基態(tài)時，以熱或發(fā)射光譜的形式將能量釋放出來。所發(fā)射出的相應(yīng)光譜，稱分子發(fā)射光譜。10E1E0吸收光譜發(fā)射光譜激發(fā)態(tài)基態(tài)E1＞E011

（1）根據(jù)產(chǎn)生光譜的物質(zhì)結(jié)構(gòu)原子光譜

(atomicspectrum)

分子光譜

(molecularspectrum)4.分類12（2）根據(jù)光譜獲得的方式不同①吸收光譜（Absorptionspectrum）分析法：根據(jù)溶液能吸收由光源發(fā)出的某些波長的光后所形成的特征光譜來鑒定該物質(zhì)的性質(zhì)和含量的方法。

紫外-可見分光光度法

(ultravioletandvisiblespectrophotometry)

原子吸收光譜法

(atomicabsorptionspectrophotometry)

紅外光譜法

(infraredspectrometry)13②發(fā)射光譜(emissionspectrum)分析法：

根據(jù)物質(zhì)受到熱能或電能等的激發(fā)后所發(fā)射出的特征光譜來進(jìn)行定性及定量分析的一種方法。原子發(fā)射光譜法

(atomicemissionphotometry)

分子發(fā)光分析法14

1、定義：

根據(jù)被測物質(zhì)對各種不同波長光的吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的特性鑒定物質(zhì)的方法。

屬光譜分析法。二分光光度法15可見光：

400~700nm,有色物質(zhì)溶液紫外光：

200~400nm,無色物質(zhì)162、特點：

儀器設(shè)備和操作簡單費用少，分析速度快靈敏度高(10-4~10-7g/mL)

選擇性好精確度和準(zhǔn)確度高173、應(yīng)用：（1）定性分析定性鑒定純度鑒定

結(jié)構(gòu)分析（2）定量分析18（一）光吸收的基本定律

1、定律：單色光通過吸光溶液后，吸光度與溶液的濃度和厚度之間呈正比關(guān)系。

19

（1）Lambert定律：說明吸收與溶液液層厚度間的關(guān)系L1L2入射光透過光入射光透過光L2

＞L1，I1＞I2I0I1I0I220

（2）Beer定律：說明吸收與溶液濃度間的關(guān)系21

2、表達(dá)式：

-lgI/Io=-lgT=KLC

A=-lgT=KLC

I/Io為透光率(Transmittance,T)A為吸光度(Absorbance)K為吸光系數(shù)(absorptivity)L為液層厚度

C為溶液濃度(concentration)摩爾吸光系數(shù)ε：當(dāng)溶液層厚度單位為cm，濃度單位為mol/L時，K即成為摩爾吸光系數(shù)22光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。（二）分光光度計的基本結(jié)構(gòu)232.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。243.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)檢流計、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動控制和結(jié)果處理25（三）分光光度計的類型1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價格較高。263.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池?！?/p>

=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。27儀器

可見分光光度計28儀器

紫外-可見分光光度計29Beckman紫外-可見分光光度計eppendorf紫外-可見分光光度計30（四）分光光度計的操作方法A.分光光度計的基本操作以721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。2.將波長旋至測定的波長。3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關(guān)置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。5.將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.06.重復(fù)步驟4和57.將校準(zhǔn)液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A）31B.吸光度的校正

鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計的吸光度。在25℃，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度。32使用圖示 1.開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱10分鐘，選擇開關(guān)置于“T”

。2.打開試樣室蓋（光門自動關(guān)閉），調(diào)節(jié)“0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。333.將裝有溶液的比色皿放置比色架中。4.旋動波長手輪，把測試所需的波長調(diào)節(jié)至刻度線處。345.蓋上樣品室蓋，將參比溶液比色皿置于光路，調(diào)節(jié)透過率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0T”（如果顯示不到100%T，則可適當(dāng)增加靈敏度的檔數(shù)，同時應(yīng)重復(fù)“2”，調(diào)整儀器的“00.0”）。 356.將參比溶液比色皿置于光路中，將選擇開關(guān)置于A，旋動吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為.000，然后移入被測溶液，顯示值即為試樣的吸光度A值。368．全部測定結(jié)束后，取出比色皿(洗凈)，關(guān)閉開關(guān).37三、分光光度技術(shù)的定性和定量方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法定性依據(jù)：最大吸收波長λmax和摩爾吸光系數(shù)ε2.摩爾吸光系數(shù)ε方法1.最大吸收波長λmax方法38（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法

將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過程顯色后，分別測吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線(至少要5點)。在相同條件下處理待測物質(zhì)并測定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對應(yīng)的濃度方法：39AXCXA（吸光度）C（濃度）40制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意下面幾點：（1）測定條件發(fā)生變化時（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3）當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。（4）標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的條件完全一致。412．比較法

CX=(AX×Cs)/As

己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為：

其中Cx和Ax為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。423．其它分析方法

包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。43四、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（三）熒光光度分析法1．基本原理2．組成1．基本原理2．組成3．原子吸收分光光度法的特點

3．熒光光度定量分析法4．熒光光度分析技術(shù)的應(yīng)用1．基本原理2．影響熒光強(qiáng)度的因素44火焰光度法——等離子體發(fā)射光譜法45原子吸收分光光度法46熒光光度法NanoDrop?ND-3300Fluorospectrometer

47第二節(jié)電化學(xué)分析電化學(xué)分析方法基本原理離子選擇電極分類離子選擇電極的分析方法48電化學(xué)分析是利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測定化學(xué)電池電位、電流或電量的變化進(jìn)行分析的方法。電化學(xué)分析方法電位分析法：測定原電池電動勢以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法：通過電阻測定以求物質(zhì)含量的分析方法電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點的指示49電位分析法是利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來確定物質(zhì)含量的分析方法。一、電化學(xué)分析方法基本原理原電池是利用兩個電極之間金屬性的不同,產(chǎn)生電勢差,從而使電