高級食品微生物學(xué)- 課件 第7-9章 腸道菌群、發(fā)酵食品中的微生物群、微生物的系統(tǒng)生物學(xué)研究技術(shù)

第七章腸道菌群1/38目錄2/38第一節(jié)腸道微生物群概述第二節(jié)腸道微生物與免疫系統(tǒng)相互作用第三節(jié)腸道微生物與代謝類疾病第四節(jié)腸道微生物與其它疾病第五節(jié)腸道菌群與食物的相互作用3/38第一節(jié)腸道微生物群一、定義腸道微生物群：亦稱腸道菌群，是人體內(nèi)腸道的微生物，人體的腸道內(nèi)大約寄生著10萬億個細(xì)菌，能合成人體生長發(fā)育必須的維生素、可以和蛋白質(zhì)殘渣合成氨基酸、參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，同時還能促進(jìn)礦物元素的吸收。這些營養(yǎng)物質(zhì)對健康有著重要作用，一旦缺少會引起多種疾病。它們還能影響體重和消化能力、免疫能力，還可以控制人體對藥物的反應(yīng)。4/38二、腸道微生物的分類、組成及建立分類在腸道菌群中，可以培養(yǎng)到的細(xì)菌有400余種。1）根據(jù)細(xì)菌的數(shù)量分類：主要菌群和次要菌群。5/38二、腸道微生物的分類、組成及建立主要菌群指的是腸道菌群中數(shù)量或密度比較大的細(xì)菌，包括類桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等，通常屬于原籍菌群。這種數(shù)量或者密度較大的菌群是對宿主發(fā)揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著整個菌群的功能，決定著菌群對宿主的生理病理意義。6/38二、腸道微生物的分類、組成及建立次要菌群數(shù)量較少，主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動性大，有潛在致病性，大部分屬于外籍菌群或過路菌群。乳桿菌雖然數(shù)量較少，只是在回腸中含量較高，但它具有較為重要的功，因此在功能上歸屬于優(yōu)勢菌群。7/38二、腸道微生物的分類、組成及分布2）根據(jù)對人體的作用分三個大類：有益菌、有害菌和中性菌有益菌，稱益生菌。有害菌，數(shù)量一旦失控將大量生長，這類細(xì)菌的大量生長會引發(fā)多種疾病，產(chǎn)生致癌物等有害物質(zhì)，或者影響免疫系統(tǒng)的功能。中性菌，顧名思義具有雙重作用的細(xì)菌，如大腸桿菌、腸球菌等，在正常情況下對健康有益，一旦增殖失控，或從腸道轉(zhuǎn)移到身體其他部位，就有可能會引發(fā)許多問題。8/382.組成男性（左）和女性（右）體內(nèi)腸道菌群在門（上）和屬（下）水平的組成二、腸道微生物的分類、組成及分布9/383.分布體內(nèi)腸道菌群的分布二、腸道微生物的分類、組成及分布10/384.影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和分布的因素二、腸道微生物的分類、組成及分布11/38保護(hù)腸道參與物質(zhì)代謝對機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響炎癥、癌癥、心血管疾病、肥胖、糖尿病等等。三、腸道微生物的功能12/38失調(diào)類型比例失調(diào)：I度（暫時、可逆）、II度（不可逆）和III度（引起感染，又稱菌群交替癥）。定位轉(zhuǎn)移：又稱易位，分為橫向轉(zhuǎn)移和縱向轉(zhuǎn)移。自身感染：機(jī)體抵抗力下降時，腸道的正常菌群可以轉(zhuǎn)化為條件致病菌引起自身的感染。四、腸道微生物的失調(diào)與致病13/382.致病因素藥物：抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒性藥物。飲食習(xí)慣。年齡。腸道動力異常。腸道免疫功能障礙。器官移植。四、腸道微生物的失調(diào)與致病14/383.與腸道微生物有關(guān)的疾病四、腸道微生物的失調(diào)與致病15/38第二節(jié)腸道微生物與免疫系統(tǒng)相互作用1.腸道微生物與免疫系統(tǒng)相互作用腸粘膜免疫是人類粘膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分。分為三層：外層物理保護(hù)層、中層黏液保護(hù)層、內(nèi)層免疫防御層。由黏液層、上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞共同構(gòu)成腸黏膜保護(hù)層，防止腸道共生微生物進(jìn)入機(jī)體系統(tǒng)及組織。16/38第二節(jié)腸道微生物與免疫系統(tǒng)相互作用2.免疫系統(tǒng)與腸道微生物種群相互協(xié)調(diào)以維持腸道穩(wěn)態(tài)共生菌識別TLR；共生菌調(diào)控NF-kB，下調(diào)炎癥；共生菌產(chǎn)生信號分子維持固有免疫應(yīng)答強(qiáng)度；免疫系統(tǒng)攝取共生菌并利用腸道共生菌產(chǎn)生的定植抗力抵制病原菌。宿主產(chǎn)生抗菌肽—防御素抑制病原菌，并參與病原菌引起的免疫應(yīng)答。17/38第二節(jié)腸道微生物與免疫系統(tǒng)相互作用2.免疫系統(tǒng)與腸道微生物種群相互協(xié)調(diào)以維持腸道穩(wěn)態(tài)18/38第二節(jié)腸道微生物與免疫系統(tǒng)相互作用3.在腸黏膜區(qū)域，黏膜免疫系統(tǒng)通過多種免疫應(yīng)答機(jī)制保護(hù)宿主抵御病原菌的感染：分子模式識別受體（PRRs，包括TLRs和NLRs）對病原菌的識別；IL-38-TH17細(xì)胞信號通路的激活；前炎癥性反應(yīng)的放大?？咕鞍踪|(zhì)的分泌以及招募中性粒細(xì)胞。適應(yīng)性免疫的激活將導(dǎo)致sIgA的表達(dá)與分泌。共生菌與致病菌競爭或間接通過調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)的方式幫助宿主抵御感染。19/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響炎性腸病又稱炎癥性腸?。↖BD），為累及回腸、直腸、結(jié)腸的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病。臨床表現(xiàn)腹瀉、腹痛，甚至可有血便。包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）。潰瘍性結(jié)腸炎是結(jié)腸黏膜層和黏膜下層連續(xù)性炎癥，疾病通常先累及直腸，逐漸向全結(jié)腸蔓延,克羅恩病可累及全消化道，為非連續(xù)性全層炎癥，最常累及部位為末端回腸、結(jié)腸和肛周。20/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響腸道微生物對IBD易感性的影響因素：微生物種群失調(diào)代謝效應(yīng)屏障破損先天免疫適應(yīng)性免疫腸道神經(jīng)系統(tǒng)21/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響微生物種群失調(diào)22/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響Figure2:MetabolismandbalanceofintestinalsphingolipidsinphysiologicalconditionsandIBD.

代謝效應(yīng)宿主代謝與菌群密切相關(guān)。菌群可通過引起宿主代謝改變影響炎性疾病。23/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響

PerturbationstoTrpMetabolisminDiseases代謝效應(yīng)必需氨基酸色氨酸被降解為吲哚-3-乙醛，進(jìn)而促進(jìn)固有淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-12.H和硫化氫在不同區(qū)域產(chǎn)生存在差異，參與免疫調(diào)節(jié)。24/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響屏障破損IBD時，腸屏障受損，TJS的表達(dá)和差異分布降低。這些分子的缺失或減少通過增加免疫細(xì)胞分泌的幾種促炎性細(xì)胞因子，包括IL-1β、TNF-α和IFN-γ，導(dǎo)致IBD的嚴(yán)重程度增加。腸道微生物群在調(diào)節(jié)TJS和粘膜屏障完整性方面也有重要

作用。腸道病原體能夠通過誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞浸潤增加腸道通透性來改變屏障功能。25/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響先天免疫也叫非特異性免疫，是人一生下來就具有，而特異性免疫需要經(jīng)歷一個過程才能獲得。炎癥反應(yīng)是人一生下來就有的能力。固有免疫對各種入侵的病原微生物能快速反應(yīng)，同時在特異性免疫的啟動和效應(yīng)過程也起著重要作用。26/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響先天免疫哺乳動物的免疫系統(tǒng)與其固有的微生物種群共同進(jìn)化，保持剛性平衡：對共生菌的耐受和對致病菌的威脅。平衡被破壞，產(chǎn)生炎癥。宿主免疫系統(tǒng)能識別自己和非已，既可識別微生物的保守結(jié)構(gòu)基序，也可識別細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。27/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響適應(yīng)性免疫特異性免疫(specificimmunity)又稱獲得性免疫或適應(yīng)性免疫，這種免疫只針對一種病原體。28/38二、腸道微生物對IBD易感性的影響腸道神經(jīng)系統(tǒng)腸神經(jīng)系統(tǒng)由200-600萬個神經(jīng)元組成。主要功能包括調(diào)節(jié)腸蠕動、跨黏膜液體通量、局部血流量、釋放腸激素、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和與免疫系統(tǒng)相互作用。29/38第三節(jié)腸道微生物與代謝類疾病代謝性疾病即因代謝問題引起的疾病，包括代謝障礙和代謝旺盛等原因，主要包括以下這些疾病：糖尿病糖尿病酮癥酸中毒高血糖高滲綜合征低血糖癥痛風(fēng)蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良癥維生素A缺乏病壞血病維生素D缺乏病骨質(zhì)疏松癥30/38第三節(jié)腸道微生物與代謝類疾病腸道菌群與代謝性疾病31/38第三節(jié)腸道微生物與代謝類疾病一、肥胖與腸道菌群肥胖的危害：三高引起心腦血管病、糖尿病、胰腺功能減退、膽結(jié)石、肝硬化、脂肪肝。腸道菌群可以調(diào)節(jié)人體脂肪的儲存。腸道中擬桿菌門和厚壁菌門細(xì)菌在能量代謝過程中起不同作用。32/38第三節(jié)腸道微生物與代謝類疾病二、腸道菌群參與能量代謝對人體不能直接消化的糖類復(fù)合物，腸道菌群可以降解利用這些多糖，轉(zhuǎn)化成人體可吸收利用的小分子。腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的禁食誘導(dǎo)脂肪因子可抑制人體脂蛋白酶表達(dá)，而腸道菌群可以抑制Fiaf表達(dá)，從而促進(jìn)LPL的表達(dá)，將大量甘油儲存于脂肪細(xì)胞中，誘導(dǎo)肥胖。腸道菌群可以促進(jìn)脂肪合成基因及其調(diào)節(jié)蛋白合成基因的表達(dá)，從而促進(jìn)甘油三酯在肝臟脂肪細(xì)胞中的積聚。個體腸道內(nèi)復(fù)雜的微生物種群具有“專人專用”的代謝技能，而微生物構(gòu)成特征可能影響能量的儲存或能量的消耗，從而誘發(fā)代謝相關(guān)疾病。33/38第三節(jié)腸道微生物與代謝類疾病改變腸道菌群達(dá)到減肥的目標(biāo)飲食運動藥物手術(shù)34/38第三節(jié)腸道微生物與代謝類疾病三、腸道菌群與糖尿病糖尿病分為I型、II型和妊娠糖尿病腸道微生物在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用腸道菌群作為環(huán)境因素參與I型糖尿病的發(fā)生；腸道菌群參與的發(fā)病機(jī)制可能主要與腸道通透性及免疫功能的改變有關(guān)。腸道菌群紊亂改變對食物組分的其產(chǎn)物。35/38第四節(jié)腸道微生物與其它疾病三、腸道菌群與糖尿病腸道菌群導(dǎo)致糖脂代謝紊亂的可能機(jī)制能量假說：腸道菌群可能通過過度能量存儲而導(dǎo)致代謝疾病的發(fā)生；炎癥假說。36/38第四節(jié)腸道微生物與其它疾病腸道健康問題是萬病之源。37/38第五節(jié)合理飲食對腸道菌群和機(jī)體代謝的改善作用飲食是決定腸道菌群的主要因素。飲食中的不同營養(yǎng)物質(zhì)會影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能。膳食纖維是腸道菌群的主要營養(yǎng)來源。脂肪、蛋白質(zhì)、植物源生物活性營養(yǎng)素、食品添加劑、礦物質(zhì)等。飲食模式、飲食量、進(jìn)食頻率和時間。謝謝38THANKYOU發(fā)酵食品中的微生物群第八章目錄第一節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和演變第二節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性第三節(jié)

我國傳統(tǒng)釀造食品微生物生態(tài)學(xué)及其研究策略第四節(jié)

合成微生物群及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用41/27第一節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和演變1.乳酸菌廣泛存在于許多發(fā)酵食品和飲料中2.芽孢桿菌存在于亞洲和非洲的堿性發(fā)酵食品中3.酵母菌用于發(fā)酵食品、酒精飲料和非食品混合淀粉水解起始劑4.絲狀霉菌在發(fā)酵食品和酒精飲料中的主要作用是產(chǎn)生酶和降解抗?fàn)I養(yǎng)因子5.幾種考克氏菌、微球菌和葡萄球菌存在于發(fā)酵乳制品、發(fā)酵香腸、肉和魚制品中一、發(fā)酵食品中的微生物概覽42/27根據(jù)植物/動物來源使用的底物(原料)可以將全球發(fā)酵食品分為九大類：①發(fā)酵谷物；②發(fā)酵蔬菜和竹筍；③發(fā)酵豆類；④發(fā)酵塊根塊莖；⑤發(fā)酵乳制品；⑥發(fā)酵和腌制肉制品；⑦發(fā)酵、干燥和熏制的魚制品；⑧各種發(fā)酵產(chǎn)品；⑩酒精飲料。二、全球發(fā)酵食品中的微生物發(fā)酵乳制品

發(fā)酵乳制品根據(jù)微生物分為兩大類：①乳酸發(fā)酵，主要是乳酸菌；②真菌-乳酸發(fā)酵，乳酸菌和酵母菌合作產(chǎn)生最終產(chǎn)品。2.發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品

蔬菜的發(fā)酵主要以乳桿菌屬和片球菌屬為主，其次是明串珠菌屬、魏氏菌屬、四聯(lián)球菌屬和乳球菌屬。第一節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和演變43/273.傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品

發(fā)酵大豆食品主要有兩種類型：由具有黏性特征的芽孢桿菌（主要是枯草桿菌）發(fā)酵的大豆食品，以及由絲狀霉菌（主要是曲霉、毛霉、根霉）發(fā)酵的大豆食品。4.發(fā)酵根和塊莖產(chǎn)品木薯的根部在傳統(tǒng)上會被發(fā)酵成主食，木薯發(fā)酵的初始階段以木薯棒狀桿菌為主，之后加入一連串的乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵。二、全球發(fā)酵食品中的微生物第一節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和演變44/275.發(fā)酵肉制品參與肉類發(fā)酵的主要微生物群是乳酸菌，其次是凝固酶陰性葡萄球菌、微球菌和腸桿菌科。6.發(fā)酵水產(chǎn)品

世界上發(fā)酵和傳統(tǒng)保存的魚產(chǎn)品中都存在幾種細(xì)菌和酵母菌。蝦醬中發(fā)光桿菌屬是其主要的優(yōu)勢菌屬，所占比例達(dá)到71.94%；其次是弧菌屬，比例為12.54%。7.其他發(fā)酵食品

例如在鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵階段醋酷中的優(yōu)勢微生物為醋酸菌、乳酸菌和酵母，三者占細(xì)菌和真菌總和的80%以上，巧克力是可可豆發(fā)酵的產(chǎn)物，發(fā)酵乳酸桿菌和巴氏醋酸桿菌是其主要的細(xì)菌種類。二、全球發(fā)酵食品中的微生物第一節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和演變45/27世界上的酒精飲料分為以下10種類型。(1)由淀粉分解發(fā)酵劑生產(chǎn)的非蒸餾，且不經(jīng)過濾的酒精飲料

例如印度和尼泊爾的kodokojaanr(由鴨腳粟發(fā)酵)和bhaatijaanr(由米飯發(fā)酵)，韓國的Makgeolli(由米飯發(fā)酵)。(2)由淀粉分解發(fā)酵劑生產(chǎn)的非蒸餾，但經(jīng)過濾的酒精飲料

例如日本的清酒(sake)和我國的黃酒。(3)用淀粉分解發(fā)酵劑生產(chǎn)的蒸餾酒精飲料

例如我國的白酒、日本的燒酒(shochu)和韓國的燒酒(soju)。(4)生產(chǎn)過程中有人類唾液淀粉酶所參與的酒精飲料

例如秘魯?shù)腸hicha。第一節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和演變?nèi)?、含酒精的飲?6/27世界上的酒精飲料分為以下10種類型。(5)通過單菌株發(fā)酵生產(chǎn)的酒精飲料，例如啤酒。(6)由蜂蜜制成的酒精飲料，例如埃塞俄比亞的tej。(7)由植物的特定部分制成的酒精飲料，例如墨西哥的pulque和印度的toddy和kanji。(8)通過麥芽(發(fā)芽)生產(chǎn)的酒精飲料，例如南非的高粱啤酒(bantu)、尼日利亞和加納的皮托(pito)，以及貝寧的tchoukoutou。(9)由水果制成，但不經(jīng)過蒸餾的酒精飲料，例如葡萄酒(wine)、蘋果酒(cider)。(10)由水果和谷物制成的蒸餾酒精飲料，例如威士忌(whisky)和白蘭地(brandy)。三、含酒精的飲料第一節(jié)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和演變47/27第二節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化動植物原料的化學(xué)成分提高營養(yǎng)的生物利用率豐富食品的感官質(zhì)量提供生物防腐效果和改善食品安全降解有毒成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子產(chǎn)生抗氧化劑和抗微生物化合物刺激益生菌功能，并添加一些促進(jìn)健康的生物活性化合物功能微生物在食品發(fā)酵過程中的作用：48/27第二節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性一、傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝

通過分析發(fā)酵食品菌相組成與代謝物之間的相關(guān)性，從而找到發(fā)酵體系中的功能微生物群，這種方法是尋找復(fù)雜發(fā)酵系統(tǒng)中核心微生物群的主要方法之一。例如，表8-8中利用宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)在乳酪中發(fā)現(xiàn)了部分微生物與風(fēng)味物質(zhì)（代謝產(chǎn)物）之間的聯(lián)系。49/271.抗菌性能

從發(fā)酵蔬菜和乳制品中分離得到的許多種乳酸菌均具有抗菌活性，這是由于這些細(xì)菌產(chǎn)生了細(xì)菌素和乳鏈球菌素等抗菌化合物。2.抗氧化活性

發(fā)酵食品中的抗氧化活性包括有：1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除活性、

2,2‘-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS)自由基清除活性、總酚含量(TPC)和還原能力測定。

亞洲的許多發(fā)酵大豆食品均具有抗氧化性。3.多肽生產(chǎn)在發(fā)酵食品中發(fā)現(xiàn)的多肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗血栓和抗高血壓特性等功能特性。芽孢桿菌屬的細(xì)菌參與了蛋白質(zhì)的酶解，從而產(chǎn)生了有益于健康的多肽和氨基酸。二、傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的功能性質(zhì)

第二節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性50/274.微生物產(chǎn)酶

在亞洲的許多發(fā)酵大豆食品中，由芽孢桿菌屬細(xì)菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶（如蛋白酶等），能將復(fù)雜化合物分解成多種具生物活性的簡單生物分子。發(fā)酵食品和飲料中常見的菌絲真菌(如放射霉菌)能產(chǎn)生各種碳水化合物酶。5.異黃酮皂苷的增加和聚合氨酸(PGA)的生產(chǎn)

亞洲一些發(fā)酵大豆食品的發(fā)酵過程中，異黃酮糖苷被水解成相應(yīng)的苷元。聚谷氨酸(PGA)是由

發(fā)酵大豆食品中的一些芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生。6.抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的降解

發(fā)酵食品中存在的一些微生物可能會將阻礙營養(yǎng)吸收的物質(zhì)降解，從而使食品的營養(yǎng)價值提高。第二節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性二、傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的功能性質(zhì)

51/277.發(fā)酵食品治療作用

許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品既是食物，也是藥物，既可飽腹，又可發(fā)揮一定治療功效。例如紅葡萄酒由于

含有調(diào)節(jié)生物鐘的褪黑素而具有抗衰老的特性。8.營養(yǎng)素的合成食品發(fā)酵過程中會富集一些維生素、必需氨基酸和生物活性化合物。9.預(yù)防高血壓和心臟病發(fā)酵全谷物食品可以降低血清低密度脂蛋白膽固醇，改善高甘油三酯血癥和高血壓。10.預(yù)防癌癥一些發(fā)酵食品具有抗突變和抗癌活性。第二節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性二、傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的功能性質(zhì)

52/2711.對胃腸道疾病的防護(hù)

發(fā)酵食品中存在的乳酸菌可能會降低某些胃腸道疾病的發(fā)生率、持續(xù)時間和嚴(yán)重程度。12.抗過敏反應(yīng)

從開菲爾(kefir)中分離得到的馬乳酒樣乳酸桿菌M1具有抗過敏作用。13.預(yù)防糖尿病和骨質(zhì)疏松癥第二節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性二、傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的功能性質(zhì)

攝入高纖維食物可能會減少糖尿病患者的胰島素需求，并可能增加非糖尿病患者對胰島素的敏感性。納豆中所含有的維生素I&刺激骨骼的形成，這可能有助于預(yù)防日本老年婦女的骨質(zhì)疏松癥。而酸乳中所含的礦物質(zhì)元素(鎂、鈣、磷和鉀)則能與蛋白一同作用，促進(jìn)健康骨骼的形成。53/2714.緩解乳糖吸收不良

第二節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的代謝和功能特性二、傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的功能性質(zhì)

15.發(fā)酵食品的健康風(fēng)險發(fā)酵食品中的重要健康風(fēng)險之一是生物胺的存在。生物胺存在于酸菜、魚產(chǎn)品、奶酪、葡萄酒、啤酒、干制香腸等發(fā)酵食品中。腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌是食品中生物胺的主要生產(chǎn)者。用于生產(chǎn)酸乳的德爾乳酸桿菌保加利亞亞種含有大量半乳糖苷酶，可改善乳糖不耐受者的乳糖吸收不良癥狀。

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傳統(tǒng)釀造食品已經(jīng)成為我國的文化符號，在現(xiàn)代工業(yè)高度發(fā)展的今天，仍以其獨特的魅

力被大家廣泛接受和喜愛，在國民的日常生活及經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有非常重要的地位。傳統(tǒng)釀造具有食品原料復(fù)雜、參與釀造過程的微生物多、代謝反應(yīng)多、工藝繁復(fù)等特點，使得科學(xué)闡釋傳統(tǒng)釀造過程存在巨大的挑戰(zhàn)。

基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生物信息分析技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為研究發(fā)酵過程中微生物群落

結(jié)構(gòu)與功能、微生物群落內(nèi)部及其與環(huán)境的交互等提供了有力的支撐，使得科學(xué)描述

和解釋傳統(tǒng)發(fā)酵食品的釀造技藝成為可能。第三節(jié)我國傳統(tǒng)釀造食品微生物生態(tài)學(xué)及其研究策略55/27一、中國傳統(tǒng)食品釀造微生態(tài)的環(huán)境特點中國傳統(tǒng)釀造食品種類繁多，各類型的發(fā)酵過程中形成的微生態(tài)各不相同，但它們的釀造環(huán)境仍存在一些共同的特點。1.極端環(huán)境條件驅(qū)動微生物群落的自我凈化2.固態(tài)發(fā)酵方式?jīng)Q定微生態(tài)環(huán)境具有較大的空間差異性第三節(jié)我國傳統(tǒng)釀造食品微生物生態(tài)學(xué)及其研究策略56/27二、中國傳統(tǒng)釀造食品的微生物生態(tài)學(xué)研究策略中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生態(tài)系統(tǒng)具有高度的復(fù)雜性對于一個復(fù)雜體系，只有在遵循微生物內(nèi)部及其與環(huán)境復(fù)雜的交互作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，解析微生物群落結(jié)構(gòu)、明確其代謝功能，在錯綜復(fù)雜的微生物交互作用網(wǎng)絡(luò)中錨定核心功能微生物，才能實現(xiàn)有效地調(diào)控代謝功能。1.剖析傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落的構(gòu)成

目前研究發(fā)酵食品中群落結(jié)構(gòu)的手段主要可分為依賴純培養(yǎng)的方法和不依賴純培養(yǎng)的方法。表8-11分別介紹了不依賴純培養(yǎng)的各方法的研究范疇和優(yōu)缺點。第三節(jié)我國傳統(tǒng)釀造食品微生物生態(tài)學(xué)及其研究策略57/271.剖析傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落的構(gòu)成第三節(jié)我國傳統(tǒng)釀造食品微生物生態(tài)學(xué)及其研究策略58/27二、中國傳統(tǒng)釀造食品的微生物生態(tài)學(xué)研究策略3.關(guān)注復(fù)雜的微生物群落內(nèi)部及其與環(huán)境之間的互作關(guān)系（1）微生物群落內(nèi)部微生物之間的交互作用是普遍而廣泛存在的，并且是決定群落結(jié)構(gòu)和功能的內(nèi)在因素之一。目前關(guān)于中國傳統(tǒng)釀造食品中微生物交互作用的研究大多采用純培養(yǎng)結(jié)合共培養(yǎng)的方式。（2）微生物與環(huán)境之間也有復(fù)雜的交互作用關(guān)系系統(tǒng)理解傳統(tǒng)釀造食品的發(fā)酵進(jìn)程，需要明晰環(huán)境與微生物之間的互作機(jī)制，才能更好地理解傳統(tǒng)工藝的科學(xué)性，進(jìn)而建立調(diào)控群落功能的有效策略。4.調(diào)控微生物群落的釀造功能2.解析微生物群落的代謝功能

針對復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落代謝行為的研究，需要架構(gòu)起微生物群落和代謝物之

間的交互橋梁。第三節(jié)我國傳統(tǒng)釀造食品微生物生態(tài)學(xué)及其研究策略59/27三、中國傳統(tǒng)釀造食品的微生物生態(tài)學(xué)研究展望目前的研究在微生物群落結(jié)構(gòu)、代謝功能方面提供了基礎(chǔ)信息，未來需要對這一復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)一步深入解析，以實現(xiàn)科學(xué)闡釋傳統(tǒng)釀造技藝的科學(xué)性，為進(jìn)一步推動產(chǎn)業(yè)提升奠定基礎(chǔ)。1.多組學(xué)信息的有效整合是闡明傳統(tǒng)發(fā)酵食品復(fù)雜微生物群功能的有效切入點。2.培養(yǎng)功能性微生物是關(guān)鍵步驟。3.自上而下和自下而上的研究并舉。4.使用數(shù)學(xué)模型和建立預(yù)測模型是未來研究中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的重要發(fā)展方向，是產(chǎn)品品質(zhì)

保障和進(jìn)一步提升的重要支撐。5.人工功能核心微生物群落的構(gòu)建。傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落中的關(guān)鍵少數(shù)微生物對于推進(jìn)發(fā)酵的進(jìn)程有決定性作用。第三節(jié)我國傳統(tǒng)釀造食品微生物生態(tài)學(xué)及其研究策略60/27近年來，隨著食品發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用需求的不斷提高，加上功能單一的菌種在提高風(fēng)味品質(zhì)方面存在著局限性，使得利用多種功能微生物組合來構(gòu)建合成微生物群落成了發(fā)酵食品領(lǐng)域中一個研究的熱點。一、

合成微生物群落的概念合成微生物群落是指在明確培養(yǎng)基質(zhì)的條件下，人工將兩種或兩種以上遺傳背景清晰的微生物通過共同培養(yǎng)而形成的微生物群體，其組成可以是自然界中不一定共存的野生型菌株，也可以是一個或多個經(jīng)基因改造的工程菌株。第四節(jié)合成微生物群及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用61/27二、

合成微生物群落的特征1.可人工選擇合成微生物群落的組成生物種類2.可調(diào)控合成微生物群落的空間結(jié)構(gòu)3.可人為控制合成微生物群落的位置和數(shù)量分布第四節(jié)合成微生物群及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用62/27三、合成微生物群落相互作用和調(diào)控機(jī)制可以通過改變細(xì)胞交流、物種代謝作用、生長環(huán)境等方式對微生物間的相互作用進(jìn)行調(diào)控，從而對合成微生物群落進(jìn)行改造，實現(xiàn)特定的功能。1.微生物間的相互作用研究物種間的相互作用可以分為積極的和消極的兩種類型，積極的相互作用包括共生(互利共生和偏利共生)，消極的相互作用包括寄生、捕食以及競爭。由于菌種間存在復(fù)雜的交互關(guān)系，因此在構(gòu)建微生物群落時要考慮參與菌種的功能、分布和生長環(huán)境等眾多因素，而不是將多種微生物進(jìn)行隨機(jī)組合。2.基于代謝作用對微生物間相互作用調(diào)控在合成微生物群落中的微生物之間可以通過交換代謝物進(jìn)行交流，利用資源的共享實現(xiàn)微生物間的相互作用。此外，群落中的微生物還可以通過交換代謝中間物來影響彼此的活動，這些代謝中間物可以促進(jìn)或抑制對方的生長，實現(xiàn)物種間的相互作用，進(jìn)而協(xié)調(diào)整個群落的活動。第四節(jié)合成微生物群及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用63/27四、合成微生物群的應(yīng)用

近年來，隨著科技的不斷發(fā)展和對單菌種研究的不斷增加，通過將理論與技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建出穩(wěn)定高效的微生物群落，使得合成微生物群落應(yīng)用不斷擴(kuò)展，其中包括發(fā)酵食品領(lǐng)域主要涉及醬油、白酒、食醋、酸乳等的生產(chǎn)應(yīng)用。1.醬油生產(chǎn)應(yīng)用2.白酒生產(chǎn)應(yīng)用3.食醋生產(chǎn)應(yīng)用4.酸乳生產(chǎn)應(yīng)用第四節(jié)合成微生物群及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用64/27五、合成微生物學(xué)與發(fā)酵食品的發(fā)展方向現(xiàn)階段對食品發(fā)酵微生物種群的作用關(guān)系和代謝網(wǎng)絡(luò)的研究較少，想要調(diào)控微生物群落的發(fā)酵功能必須了解參與各種發(fā)酵生化反應(yīng)的微生物，通過代謝網(wǎng)絡(luò)模塊化處理將發(fā)酵任務(wù)分解，確定關(guān)鍵微生物的單元任務(wù)，并通過調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)和強(qiáng)化菌株功能來實現(xiàn)調(diào)節(jié)微生物群落的代謝功能的目標(biāo)。今后隨著對于食品微生物群落的組成、功能和相互作用的深入研究，借助合成微生物群落的理論和研究方法，設(shè)計和構(gòu)建出穩(wěn)定高效的靶向精準(zhǔn)的合成食品發(fā)酵微生物群落，將對我國發(fā)酵食品發(fā)展進(jìn)步有著重要意義。第四節(jié)合成微生物群及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用謝謝THANKYOU第九章微生物的系統(tǒng)生物學(xué)研究技術(shù)66/34目錄CONTENTS67/34蛋白質(zhì)組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)微生物基因組學(xué)人體微生態(tài)研究前沿68/34生物系統(tǒng)是一個非常復(fù)雜的體系。首先，在單個細(xì)胞內(nèi)，儲存信息的基因表達(dá)出有生物功能的蛋白質(zhì)以及代謝子，然后，這些基本成分形成高層次的調(diào)控模體和代謝通路，大量的模體和通路進(jìn)一步構(gòu)成基本的功能模塊，最后，多個功能模塊組成更復(fù)雜的大尺度多細(xì)胞生物網(wǎng)絡(luò)。系統(tǒng)生物學(xué)：系統(tǒng)生物學(xué)是研究系統(tǒng)組成成分的構(gòu)成與相互關(guān)系的結(jié)構(gòu)、動態(tài)與發(fā)生，以系統(tǒng)論和實驗、計算方法整合研究為特征的新型學(xué)科，由基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等構(gòu)成，其最大的特點在于全域性，具有典型的多學(xué)科交叉研究的特點，可以在整體規(guī)模上描述生物反應(yīng)過程及其調(diào)控機(jī)制，因此，系統(tǒng)生物學(xué)又被稱為組學(xué)時代的代謝工程人體微生態(tài)前沿69/34意義：建立在全基因組序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，通過整合其他組學(xué)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)的研究策略，可讓研究者從全基因組規(guī)模去全面理解微生物發(fā)生在基因、蛋白質(zhì)、生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物等層次上的時序變化；全面理解細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)、調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及遺傳和環(huán)境擾動對細(xì)胞全局代謝的影響，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展代謝工程策略，從而為從整體水平上闡明微生物生理活動規(guī)律及定向改善微生物細(xì)胞的表型和生產(chǎn)性狀創(chuàng)造了可能。因此，綜合運用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)來闡釋和解析微生物的生理和功能已成為研究熱點問題人體微生態(tài)前沿70/34微生物基因組學(xué)一、基因組學(xué)的概念基因組學(xué)(Genomics)是指對所有基因進(jìn)行基因組繪圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)。研究范圍：以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(StructuralGenomics)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(FunctionalGenomics),又被稱為后基因組(Postgenome)研究。特點：與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行的研究相比，基因組學(xué)研究是通過結(jié)合全基因組序列信息和生物體的功能和結(jié)構(gòu)，從基因組水平去認(rèn)識和理解整個生物體的生理和行為，因而具有更全面、深刻、細(xì)致等顯著特點。71/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義1、研究意義微生物是指一切肉眼看不見或看不清的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、病毒、真菌和少數(shù)藻類等。微生物相對于其他生物體而言，結(jié)構(gòu)簡單、基因組較小，對其整體的基因調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)的研究將給基因組學(xué)的研究開辟出一條新的道路，也將極大地促進(jìn)發(fā)酵業(yè)、制藥業(yè)、疫苗生產(chǎn)、環(huán)保產(chǎn)業(yè)等工農(nóng)業(yè)的發(fā)展。微生物基因組的研究成果不僅可以極大地推動理論科學(xué)的發(fā)展，還能以多種形式廣泛地應(yīng)用于人類生產(chǎn)生活中，對人類生活所產(chǎn)生的影響也是難以估計的。微生物基因組學(xué)72/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、發(fā)展現(xiàn)狀1995年，采用全基因組隨機(jī)測序法(Whole-GenomeShotgunSequencing)成功地完成了流感嗜血桿菌全基因組序列測定和組裝。截至2014年1月，已經(jīng)完成的細(xì)菌基因組有4419個，正在測序的超過300個。2007年底，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)宣布將投入1.15億美元啟動“人類微生物組計劃”。目標(biāo)是通過繪制人體不同器官中微生物元基因組圖譜，解析微生物菌群結(jié)構(gòu)變化對人類健康的影響。2009年8月1日，來自國內(nèi)二十多家科研機(jī)構(gòu)的中國科學(xué)家共同發(fā)起“萬種微生物基因組計劃”，該計劃的研究領(lǐng)域涵蓋了工業(yè)微生物、農(nóng)業(yè)微生物、醫(yī)學(xué)微生物等，研究種類包括古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、藻類和病毒，項目的終極目標(biāo)是建立一個中國微生物資源的基因組百科全書。微生物基因組學(xué)73/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年，Maxam和Gilbert等發(fā)明了化學(xué)降解法。此后，在Sanger法的基礎(chǔ)上，20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)了以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號接收器和計算機(jī)信號分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動測序儀。另外，20世紀(jì)90年代中期出現(xiàn)的毛細(xì)管電泳技術(shù)使得測序的通量大為提高。基于上述方法，第一代全基因組測序策略主要有兩種：以克隆為基礎(chǔ)的鳥槍法測序(Clone-basedShotgunSequencing)和全基因組鳥槍測序法(WholeGenomeShot-gunSequencing)。微生物基因組學(xué)74/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略基于上述方法，第一代全基因組測序策略主要有兩種：以克隆為基礎(chǔ)的鳥槍法測序(Clone-basedShotgunSequencing)和全基因組鳥槍測序法(WholeGenomeShot-gunSequencing)。以克隆為基礎(chǔ)的鳥槍法測序是先將基因組分離構(gòu)建BAC文庫，制作基因組的物理圖譜，然后挑選出一些重疊效率較高的克隆群，再對這些克隆進(jìn)行鳥槍法隨機(jī)測序。全基因組鳥槍測序法是直接將全基因組隨機(jī)打斷成小片段DNA,構(gòu)建質(zhì)粒文庫，然后對質(zhì)粒兩端進(jìn)行隨機(jī)測序。與前一種方法相比，該法省去了復(fù)雜的構(gòu)建物理圖譜的過程，能夠快速地對基因組進(jìn)行測序。微生物基因組學(xué)75/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略隨著測序技術(shù)的改進(jìn)，成熟的第二代測序儀推出。第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序(SequencingbySynthesis),即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括454FLX、SolexaGenomeAnalyzer和SOLIDsystemo。優(yōu)點:454FLX的測序片段比較長，片段(Read)能達(dá)到400bp;Solexa測序性價比最高，不僅機(jī)器的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準(zhǔn)確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%,而在15X覆蓋率時的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。微生物基因組學(xué)76/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略目前，以單分子測序為主要特征的第三代測序技術(shù)已經(jīng)初現(xiàn)端倪。第三代測序技術(shù)解決了錯誤率的問題，通過增加熒光的信號強(qiáng)度及提高儀器的靈敏度等方法，使測序不再需要PCR擴(kuò)增這個環(huán)節(jié)，實現(xiàn)了單分子測序，并繼承了高通量測序的優(yōu)點。盡管第三代測序技術(shù)尚處于研發(fā)及應(yīng)用的初級階段，然而新的測序技術(shù)的不斷發(fā)明，將為全球范圍內(nèi)的微生物基因組學(xué)研究帶來前所未有的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。同時，幾種測序技術(shù)之間互相補(bǔ)充和結(jié)合將給微生物基因組學(xué)的研究帶來全新的變革。微生物基因組學(xué)77/34一、蛋白質(zhì)組概念蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念在1994年首次提出，是指由一個細(xì)胞、一個組織或有機(jī)體所表達(dá)的全部的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的分析蛋白質(zhì)的方法是通過對單個蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行實驗分析，包括分析酶的活性以及對細(xì)胞過程的影響等等。而蛋白質(zhì)組是一個整體的概念，是應(yīng)用二維凝膠電泳、質(zhì)譜和生物信息學(xué)等分析技術(shù)從整體上研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中的功能。根據(jù)其研究內(nèi)容主要分為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)，研究的熱點主要集中于三個方面：針對有關(guān)基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的生物體或組織細(xì)胞,建立蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組的組成性蛋白質(zhì)組學(xué)；以重要生命過程或重大疾病為對象,進(jìn)行重要生理病理狀態(tài)或過程的比較蛋白質(zhì)組學(xué)；通過多種先進(jìn)技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白質(zhì)，即相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)等。蛋白組學(xué)78/34二、蛋白質(zhì)組學(xué)原理及研究的基本流程蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展有賴于對基因表達(dá)產(chǎn)物一蛋白質(zhì)進(jìn)行高效率的大規(guī)模的分離與鑒定。蛋白質(zhì)組分析常用技術(shù)手段包括：①蛋白質(zhì)分離技術(shù)，如雙向凝膠電泳；②蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，如質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)和多肽的C端、N端測序等；③用于蛋白質(zhì)相互作用，如酵母雙雜交技術(shù)等；④生物信息學(xué)技術(shù)等。較為傳統(tǒng)的方法是采用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，再通過質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。蛋白組學(xué)79/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)1、蛋白質(zhì)提取技術(shù)通常選擇細(xì)胞或組織中的全部蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。制備合適的蛋白質(zhì)樣品是蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵，必須根據(jù)實驗?zāi)康暮筒煌瑯悠愤x擇合理的蛋白質(zhì)提取分離方法，盡可能提高樣品的溶解度，抽提最大量的蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)的損失。同時,在蛋白質(zhì)提取時，為降低樣品的復(fù)雜性，可以通過順序抽提法、亞細(xì)胞分離技術(shù)等手段對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)分離。一般而言，蛋白質(zhì)組樣品的制備過程主要包含裂解細(xì)胞或組織樣品，對蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解、變性和解聚，去除非蛋白質(zhì)成分，提取全部蛋白質(zhì)。蛋白組學(xué)80/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)1、蛋白質(zhì)提取技術(shù)通常選擇細(xì)胞或組織中的全部蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。制備合適的蛋白質(zhì)樣品是蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵，必須根據(jù)實驗?zāi)康暮筒煌瑯悠愤x擇合理的蛋白質(zhì)提取分離方法，盡可能提高樣品的溶解度，抽提最大量的蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)的損失。同時,在蛋白質(zhì)提取時，為降低樣品的復(fù)雜性，可以通過順序抽提法、亞細(xì)胞分離技術(shù)等手段對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)分離。一般而言，蛋白質(zhì)組樣品的制備過程主要包含裂解細(xì)胞或組織樣品，對蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解、變性和解聚，去除非蛋白質(zhì)成分，提取全部蛋白質(zhì)。蛋白組學(xué)81/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)2、蛋白質(zhì)檢測技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，雙向凝膠電泳(2-DE)是目前應(yīng)用最為廣泛的研究方法。其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子質(zhì)量特性區(qū)分各種蛋白質(zhì)，第一向是等電聚焦(IEF)電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點進(jìn)行分離。每個蛋白質(zhì)都是兩性分子，在不同的pH條件下可能帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷，在進(jìn)行電泳的過程中，它們會自動遷移到使其自身靜電荷為零的pH，所以在電場的作用下，不同的蛋白點聚焦到不同的位置。第二向是二十烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量不同分離蛋白質(zhì),通過二維電泳可以將復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。雖然二維凝膠電泳難以檢測到低豐度蛋白質(zhì)以及一些疏水性蛋白質(zhì)，對操作的要求也較高，但其通量高、分辨率和重復(fù)性好以及可與質(zhì)譜連用的特點，使其成為常用的一種技術(shù)手段。蛋白組學(xué)82/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)2、蛋白質(zhì)檢測技術(shù)差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE在技術(shù)上的改進(jìn)，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?即在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，采用不同的熒光標(biāo)記混合后進(jìn)行2-DE來檢測蛋白質(zhì)在兩種樣品中的表達(dá)情況，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。在該技術(shù)中，由于每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標(biāo)，且軟件可全自動地根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證了所檢測到的蛋白質(zhì)豐度變化的真實性。蛋白組學(xué)83/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)3、凝膠染色方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，凝膠的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法、熒光染色法、同位素標(biāo)記法。其中比較常用的是銀染法和考馬斯亮藍(lán)染色法，考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏性可以達(dá)到微克水平，而且使用該方法的成本較低，與后續(xù)質(zhì)譜鑒定方法具有相容性。相比而言，銀染法比考馬斯亮藍(lán)染色法具有更高的靈敏度，但是染色步驟比較復(fù)雜，對后續(xù)的圖譜分析以及質(zhì)譜鑒定有一定的影響。蛋白組學(xué)84/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為常用的技術(shù)。選擇雙向電泳凝膠圖中感興趣的蛋白點，切膠并經(jīng)過酶解后用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定。其基本原理是蛋白質(zhì)分子經(jīng)過離子化后，根據(jù)不同離子之間質(zhì)量電荷比的差異分離確定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，從而可以得到蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量等信息，確定蛋白質(zhì)的種類。用來分析蛋白質(zhì)和肽樣品的離子化技術(shù)主要包括電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解析（MALDI）兩種電離技術(shù),此外，還包括同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)和多維液相色譜技術(shù)等。蛋白組學(xué)85/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是近年來發(fā)展起來的一種生物質(zhì)譜技術(shù)，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和較高的分辨率。MALDI的電離方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出的。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體，當(dāng)用激光（337nm的氮激光）照射晶體時，基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，使樣品分子電離。它從固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測定其分子質(zhì)量，MALDI-TOF-MS-般用于肽質(zhì)量指紋圖譜，非?？焖伲看畏治鲋恍?~5min）、靈敏達(dá)到飛摩爾（fmol）水平,可以精確測量肽段質(zhì)量。但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。蛋白組學(xué)86/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）,利用較高的電場使樣品離子化，常用于一些復(fù)雜蛋白質(zhì)的分離鑒定。ESI-MS是利用高電場使質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫侖力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴。這一過程不斷重復(fù)，使最終的液滴非常細(xì)小，呈噴霧狀，這時液滴表面的電場非常強(qiáng)大，使分析物離子化,并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。ESI-MS從液相中產(chǎn)生離子。一般說來，肽段的混合物經(jīng)過液相色譜分離后，經(jīng)過偶聯(lián)的與在線連接的離子阱質(zhì)譜分析,給出肽片段的精確的氨基酸序列，但是，分析時間一般較長。蛋白組學(xué)87/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)（ICAT）是差異蛋白質(zhì)組研究技術(shù)中的核心技術(shù)之一,分別用含有輕重同位素的兩種標(biāo)記分子對比較研究樣品中的半胱氨酸進(jìn)行標(biāo)記，然后對混合的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。用具有不同質(zhì)量的同位素親和標(biāo)簽（IcATs）標(biāo)記處于不同狀態(tài)下的細(xì)胞中的半胱氨酸，利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對混合的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。蛋白組學(xué)88/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)多維液相色譜技術(shù)（MLC）是與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的2D-LC-MS/MS,可以檢測動態(tài)范圍10000:1內(nèi)的低豐度肽段，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究最主要的技術(shù)路線。該技術(shù)可快速、高通量地鑒定復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。最常用的是離子交換色譜-反相液相色譜的聯(lián)用，實現(xiàn)對復(fù)雜生物樣品的二維分離。而多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（MudPIT）是將不同分離模式的色譜柱以串聯(lián)的方式合并于同一根色譜柱中進(jìn)行的。該方法可對樣品量較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析，適用并且已經(jīng)成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)中大規(guī)模蛋白質(zhì)的分離鑒定。蛋白組學(xué)89/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)5、生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少的一部分，把基因組DNA序列信息分析作為源頭，找到基因組序列中代表蛋白質(zhì)和RNA基因的編碼區(qū)，在此基礎(chǔ)上，歸納、整理與基因組遺傳信息釋放及其調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄譜和蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，從而認(rèn)識代謝、發(fā)育、分化、進(jìn)化的規(guī)律，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定所得到的數(shù)據(jù)通過在數(shù)據(jù)庫中搜索得到基本的注釋信息，然后利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能。蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫包括SWISSPROT、InterPro、UniProt、蛋白質(zhì)功能分類數(shù)據(jù)庫COG、蛋白質(zhì)生物途徑檢索數(shù)據(jù)庫KEGG等。計算機(jī)分析軟件主要有蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析軟件PDQuest、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和物理信息分析-蛋白質(zhì)專家分析系統(tǒng)ExPASy、蛋白質(zhì)細(xì)胞定位分析Psort等。蛋白組學(xué)90/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)1、轉(zhuǎn)錄組的概念轉(zhuǎn)錄組是指在某一時間點生物體細(xì)胞內(nèi)全部基因轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的RNA的總稱。通過完成對轉(zhuǎn)錄組的分析，可以高通量地獲得有關(guān)基因組內(nèi)全部基因的RNA表達(dá)水平信息，可以發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平與某些細(xì)胞表型之間的內(nèi)部關(guān)系。整個轉(zhuǎn)錄組分析的主要目標(biāo)是：對所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類；確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如其起始位點、5'和3'末端、剪接模式和其他轉(zhuǎn)錄后修飾；并量化各轉(zhuǎn)錄本在發(fā)育過程中和不同條件下表達(dá)水平的變化。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)91/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)主要有基因表達(dá)系列分析(SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE)、基因芯片(Microarray)、大規(guī)模平行測序(MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)以及目前應(yīng)用最深入的RNA測序(RNA-sequencing,RNA-seq)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)92/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)基因芯片技術(shù)，此技術(shù)可以將樣品RNA轉(zhuǎn)錄成帶有熒光標(biāo)記的cDNA,這些帶有標(biāo)記的核苷酸序列可與基因芯片某一特定位點上的探針進(jìn)行雜交，通過測定雜交信號的強(qiáng)弱就可以檢測樣品細(xì)胞內(nèi)各基因的表達(dá)水平差異。這一技術(shù)的不足在于對目的基因的檢測數(shù)量及靈敏度有限，對某些異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如多順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等難以檢測。SAGE不需任何基因序列的信息,能夠全局性地檢測所有基因的表達(dá)水平，除了具有顯示基因差異表達(dá)譜的作用外，還對那些未知基因特別是那些低拷貝基因的發(fā)現(xiàn)起到了巨大的推動作用。MPSS技術(shù)是對SAGE技術(shù)的改進(jìn)，簡化了測序過程，提高了精度，但二者都是基于昂貴的第一代DNA測序技術(shù)(Sanger測序)，需要大量的測序工作，技術(shù)難度較大，而且涉及酶切、PCR擴(kuò)增、克隆等可能會產(chǎn)生堿基偏向性的操作步驟，因而限制了其推廣。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)93/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)RNA-seq通過完成對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序工作，對每條序列獲得的每個具體轉(zhuǎn)錄樣本的表達(dá)水平進(jìn)行分析統(tǒng)計，完成對表達(dá)譜的精密數(shù)字化分析檢測。RNA-seq的主要流程包括：首先，對細(xì)胞中的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫；然后，對其中的DNA進(jìn)行隨機(jī)剪