發(fā)酵工程制藥-酶類藥物的發(fā)酵制藥

生物制藥工藝課程蛋白酶的發(fā)酵制藥

蛋白酶蛋白酶是指催化蛋白質(zhì)肽鍵斷裂的一類酶，將蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及游離氨基酸，廣泛存在于動植物以及微生物細胞內(nèi)，按其作用形式可分為肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈外切酶。在蛋白酶的生產(chǎn)應(yīng)用中按其作用條件分為酸性蛋白酶(如凝乳酶)和中性蛋白酶。工業(yè)最大用途洗滌劑，為堿性蛋白酶。蛋白酶的生產(chǎn)工藝流程1.生產(chǎn)菌

2.發(fā)酵工藝

3.提取工藝

4.酶的質(zhì)量測定1.生產(chǎn)菌

蛋白酶分布廣，但由于動植物資源有限，工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用細菌和霉。酸性蛋白酶(最適pH2-5)產(chǎn)生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉等;中性蛋白酶(最適pH7-8)產(chǎn)生菌主要是枯草芽孢桿菌、米曲霉、棲土曲霉、灰色鏈霉菌等;堿性蛋白酶(最適pH9-11)主要產(chǎn)生菌為枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等。2.發(fā)酵工藝（1）培養(yǎng)基米曲霉的培養(yǎng)基:豆餅粉7.5%，(NH4)2S040.8%，水40%，KH2P040.25%，麩皮51.45%。黑曲霉的培養(yǎng)基(g/L):新鮮麩皮8.25，米糠4.5，豆餅粉1.5，(NH4)2S04O.3，K2HP04O.06，CaCl20.075，水8.6mL，pH5.5。（2）工藝流程（3）發(fā)酵條件裝料量30g/250mL三角瓶，采用變溫培養(yǎng)，32℃堆積培養(yǎng)48h，進行翻料，將溫度調(diào)至28℃繼續(xù)培養(yǎng)至120h。3.提取工藝

取發(fā)酵原料，以緩沖溶液浸提后，離心獲得粗酶粉。濃縮酶制備工藝流程為:發(fā)酵液→絮凝→離心→活性炭脫色→紙板過濾→超濾濃縮。1)絮凝取剛下罐的發(fā)酵液100mL，加人質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的絮凝劑NaAl02，室溫攪拌10min，然后倒人100mL量筒中觀察沉降情況，并記錄清液出現(xiàn)時間為分層時間，每隔5min測定清液高度，至120min為止。2)離心將發(fā)酵液裝人離心管中，在4℃條件下8000r/min離心。3)脫色選擇中顆?；钚蕴窟M行發(fā)酵液脫色，用量為1%。4)紙板過濾過濾紙板由孔徑30-50μm的棉花纖維、石棉和硅藻土組成，紙板過撞機的壓力為0.3MPa。5)膜濃縮由于蛋白酶的分子質(zhì)量為28kDa，因此選用聚丙烯膜的MMCO(截留分子質(zhì)量)為20kPa，操作壓力為0.05MPa，溫度控制在lO℃左右。4.酶的質(zhì)量測定酶性質(zhì)的測定:將一定量冷凍干燥后的酶粉溶于pH3.0乳酸緩沖溶液中，制成酶溶液，測定酶的最適溫度和pH，通過Sephadex-G75凝膠過濾層析及SDS蛋白質(zhì)電泳分析，此蛋白酶的分子質(zhì)量范圍為55-60kDa。生物制藥工藝課程淀粉酶的發(fā)酵制藥11

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，是最早實現(xiàn)了工業(yè)生產(chǎn)并且是迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的一個酶制劑品種。主要的淀粉酶可分為四大類：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶（糖化酶）和異淀粉酶。這些淀粉酶中比較重要的是α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶?？莶菥鶥F7658，α-淀粉酶是我國產(chǎn)量最大、用途最廣的一種液化型α-淀粉酶，廣泛應(yīng)用于食品制制藥、紡織等許多方面。α－淀粉酶生產(chǎn)工藝12菌種微生物培養(yǎng)法微生物培養(yǎng)條件細菌液體深層發(fā)酵中性至微堿性霉菌固體曲法微酸性一般在酶活達到最高峰時結(jié)束發(fā)酵，離心以硅藻土作為助濾劑去除菌體及不溶物。在鈣離子存在下低溫真空濃縮后，加入防腐劑、穩(wěn)定劑以及緩沖劑后就成為成品。13

為制造高活性的淀粉酶并便于貯運，可把發(fā)酵液用硫酸銨或有機沉淀劑沉淀制成粉狀酶制劑，最好貯藏在25℃以下、較干燥避光的地方。利用蛋白酶比淀粉酶的耐熱性差的特點，將α－淀粉酶的發(fā)酵液加熱處理可以使淀粉酶的儲藏穩(wěn)定性大為提高。在培養(yǎng)基中添加檸檬酸鹽可抑制某些菌株產(chǎn)生的蛋白酶，用底物淀粉進行吸附也可將淀粉酶和蛋白酶進行分離。141.生產(chǎn)工藝流程試管斜面培養(yǎng)基↓三角瓶種子↓種曲培養(yǎng)↓厚層通風(fēng)培養(yǎng)↓烘干↓粗酶制劑↓釀造等用粉碎↓抽提↓過濾↓沉淀↓壓濾↓烘干↓成品↓供助消化藥、釀造等用←調(diào)配（一）米曲霉固態(tài)法α-淀粉酶生產(chǎn)工藝151.原料將試管斜面（于32-34℃培養(yǎng)70-72h），接種到500mL三角瓶（每瓶一菌耳種菌），搖勻于32-34℃下培養(yǎng)3d，每24h扣瓶一次以防結(jié)塊，待菌體大量生長孢子轉(zhuǎn)出黃綠色時，即可作為種子用于制備種曲。2.發(fā)酵麩皮、米糠、稻殼、木薯粉、豆餅浸出液16種曲房要保持清潔，并定期用硫磺和甲醛熏蒸滅菌。種曲培養(yǎng)一般采用木制或鋁制曲盒，培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后放入種曲箱房，打碎團塊冷卻到30℃左右接入0.5～1％的三角瓶種子，拌勻后放入曲盒，料層厚度1cm左右為宜。盒上蓋一層布后放入專用的木架上，曲房內(nèi)保持30℃左右進行培養(yǎng)。蓋布應(yīng)每隔8～12h用水浸濕，以保持一定濕度，每24h扣盤一次，經(jīng)3d后，種曲成熟，麥麩上布滿黃綠色孢子。厚層通風(fēng)固體發(fā)酵，蒸煮1h后培養(yǎng)基冷卻到30℃接入0.5％的種曲，拌勻后入池發(fā)酵。前期品溫控制在30℃左右，每隔2h通風(fēng)20min，當(dāng)池內(nèi)品溫上升至36℃以上時則需要連續(xù)通風(fēng)，使溫度控制在34～36℃。當(dāng)池內(nèi)溫度開始下降后2～3h則通冷風(fēng)使品溫下降到20℃左右出池，整個發(fā)酵過程約需要28h。2.提取直接把麩曲在低溫下烘干，作為釀造工業(yè)上使用的粗酶制劑，特點是得率高、制造工藝簡單，但酶活性單位低，含雜質(zhì)較多。把麩曲用水或稀釋鹽水浸出酶后，經(jīng)過濾和離心除去不溶物后用酒精沉淀或硫酸銨鹽析，酶泥濾出烘干，粉碎后加乳糖作為填充劑最后制成供作助消化藥、釀造等用的酶制劑。特點是酶活性單位高，含雜質(zhì)較少，但得率低、成本高。18

α-淀粉酶生產(chǎn)工藝

枯草桿菌BF-7658淀粉酶是我國產(chǎn)量最大、用途最廣的一種液化型α-淀粉酶，其最適溫度65℃左右，最適pH6.5左右，pH低于6或高于10時，酶活顯著下降。其在淀粉漿中的最適溫度為80～85℃，90℃保溫10min，酶活保留87％。（二）枯草桿菌BF-7658深層液體發(fā)酵1.生產(chǎn)工藝流程無菌空氣BF-7658菌種↓孢子斜面↓種子罐↓發(fā)酵罐↑熱處理↓鹽析↓壓濾↓干燥↓粉碎↓混粉↓成品←硫酸銨補料罐→硫酸銨廢液←填充料202.生產(chǎn)工藝操作(1).斜面孢子培養(yǎng)一般采用馬鈴薯培養(yǎng)基，于37℃下培養(yǎng)72h，使菌體全部形成孢子即為成熟。茄子瓶(2).孢子懸浮液用50ml無菌生理鹽水洗下(3).種子及發(fā)酵培養(yǎng)工藝配方

種子培養(yǎng)基的組成為豆餅粉、玉米粉、NaHPO4、(NH4)2SO4、CaCl2、NH4Cl等。在37℃、攪拌轉(zhuǎn)速300r/min、通氣量1：（1.3-1.4）體積比的條件下培養(yǎng)12-24小時（對數(shù)生長期）

碳源：淀粉、玉米粉、木薯粉、濃度為2-8％。氮源：工業(yè)上常用玉米漿、豆餅粉、硫酸氨和硝酸鈉等。無機鹽：鈣離子對酶的穩(wěn)定有利，適當(dāng)?shù)牧}有利于酶的產(chǎn)生，錳鋅鐵對微生物產(chǎn)酶有刺激作用發(fā)酵溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量0-12小時1：0.67-0.74，12小時發(fā)酵結(jié)束1：（1.0-1.33），周期為40-48小時。補料從12小時開始，每小時一次，分30余次補完，補料體積相當(dāng)于基礎(chǔ)料的1/3，停止補料后6-8小時，溫度不再上升，菌體衰老，酶活不再升高，發(fā)酵即可結(jié)束，發(fā)酵完畢，發(fā)酵液中加入2％CaCl2和0.8％Na2HPO4，并加熱至50-55℃維持30分鐘，（破壞蛋白酶，促使膠體凝聚），然后冷卻到40℃進行提煉。種子罐3M3發(fā)酵罐30M3總配比基料補料豆餅粉45.65.35.5玉米粉3117.222.3Na2HPO4

0.80.80.80.8(NH4)2SO4

0.40.40.40.4NH4Cl0.150.150.130.2淀粉酶10-15萬單位100萬單位30萬單位CaCl2

-0.20.130.4體積12m3

4m3

種子及發(fā)酵培養(yǎng)工藝配方（4）.發(fā)酵管理發(fā)酵控制溫度37℃，罐壓0.5atm，通氣量：0-12小時，1:0.74；12小時以后1:（1.0-1.33），。發(fā)酵后期控制在0.9VVM。中間補料：12小時后，每隔1小時補料一次直至多40小時左右。補料結(jié)束后6-8小時，升至7.5，營養(yǎng)細胞80%不空泡，酶活不增加，放罐。種子培養(yǎng)維持罐溫37℃，罐壓0.5-0.8atm，10h后加大通風(fēng)，當(dāng)菌體處于對數(shù)生長期后期，立刻接種至大罐，種子培養(yǎng)一般14h左右。通風(fēng)比：種子罐0-10小時，1:1.3；10-14小時1:1.45A.種子發(fā)酵管理B.發(fā)酵灌管理補料優(yōu)點：（低濃度發(fā)酵和高濃度補料）有利于菌體生長產(chǎn)酶發(fā)酵后殘?zhí)恰埖?，便于提取高濃度補料可以保持環(huán)境穩(wěn)定，延長產(chǎn)酶期，增強菌體產(chǎn)酶的誘導(dǎo)作用，增加產(chǎn)酶量

發(fā)酵培養(yǎng)一般采用補料工藝，一方面可解除分解代謝阻遏效應(yīng)，另一方面也有利于pH的調(diào)節(jié)，最終達到提高產(chǎn)量的作用。補料體積和基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積一般為1:3左右。從10h左右開始補加，一般前期、后期少，中期大，根據(jù)菌體的生長情況來調(diào)整。a當(dāng)pH低于6.5，細胞生長粗壯時可酌減；當(dāng)pH高于6.5，細胞出現(xiàn)衰老并有空胞時可酌增，發(fā)酵周期一般為40h。3.提取預(yù)處理：發(fā)酵完畢，向發(fā)酵液中加入2％CaCl2與0.8%Na2HPO4,并加熱至50－55℃維持30min（破壞蛋白酶，促使膠體凝聚）然后冷卻到35-40℃進行提煉。（1）.鹽析法發(fā)酵液（35-40℃）加硅藻土助濾過濾洗滌濾餅（2.5倍水）合并濾液濃縮鹽析、過濾濾餅烘干粗酶制品45℃真空40%(NH4)2SO4沉淀物加硅藻土壓濾發(fā)酵液加1%Na2HPO4、1％CaCl2、0.5%NaCl，pH6.3－6.5,65℃15min凝聚處理冷卻到30℃壓濾除渣酶液濃縮至含固形物35％－40％乙醇提取離心分離沉淀物50℃熱風(fēng)干燥薄膜蒸發(fā)器加與其干物等量淀粉，攪拌緩加2倍量10－15℃乙醇，終濃度60％，攪拌、靜止沉淀粗酶制品（2）.乙醇淀粉吸附法chemicalengineeringdepartment25℃調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表工業(yè)上回收α-淀粉酶一般采用硫酸銨鹽析法。硫酸銨濃度、酶液的濃度和pH對鹽析效果都有影響，甚至α-淀粉酶來源或菌種不同對硫酸銨濃度的要求也不同，如枯草桿菌α-淀粉酶的硫酸銨濃度一般為37～50％不等。

（2）提取一般采用鹽析法提取，在熱處理后冷卻到35-40℃的發(fā)酵液中加入硅藻土（助濾劑）過濾，濾餅加2.5倍水洗滌，將洗滌水和濾液合并，于45℃真空濃縮數(shù)倍，加硫酸銨40％鹽析，鹽析物加入硅藻土進行壓濾，濾餅于40℃烘干磨成粉即為成品。本工藝的總收率為70％。也可以將濾液直接進行噴霧干燥制成酶粉，但這樣成品含雜質(zhì)多且有臭味，蒸汽耗量大，且容易吸濕。生物制藥工藝課程納豆激酶的發(fā)酵制藥

人體內(nèi)的血栓常引發(fā)脈管栓塞、腦血栓中風(fēng)、急性心肌梗塞等嚴(yán)重的心腦血管疾病，對中老年人的身體健康造成了很大的危害，目前全世界有血栓患者約1500萬人，潛在的溶栓劑市場有20億美元。但當(dāng)前的溶栓劑，如尿激酶(SK)和鏈激酶(UK)，它們作為第一代溶栓劑，缺乏纖維蛋白選擇性，副作用大；第二代溶栓劑如重組組織型纖溶酶原激活劑，存在著價格高的缺點等，難以成為適用于大眾的藥品。而納豆激酶具有溶栓能力強、無任何毒副

作用、成本低、可由細菌發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)點，市場前景極為誘人。須見洋行博士簡介“天然物/生理機能素材研究委員會”會長

日本倉敷藝術(shù)科學(xué)大學(xué)產(chǎn)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)部學(xué)部長

著名生命科學(xué)家“納豆激酶”的發(fā)現(xiàn)者震驚—世界下午兩點半實驗1987年，平時非常喜歡日本傳統(tǒng)飲食的須見洋行博士，有一天早晨看見飯桌上的納豆后，突然想起血栓的主要成分不就是纖維蛋白嗎？那么同樣是蛋白發(fā)酵而生成的納豆對溶栓會不會有一些作用呢？下午兩點半的時候，須見洋行博士把提取的納豆加入到人工血栓中，原本準(zhǔn)備第二天來看實驗結(jié)果，五點的時候，他看了一眼，奇跡發(fā)生了……納豆激酶的性質(zhì)納豆激酶(Nattokinase,NK;也稱SubtilisinNAT,SubtilisinBSP)是由納豆菌(Bacillussubtilisvar.natto)產(chǎn)生的一種具有強烈溶栓功能的蛋白酶，是一種枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)，屬于水解酶類，催化蛋白質(zhì)的水解。酶的分子量為27728，遠小于尿激酶的分子量54000。其pI值為8.6?；钚孕Ч霉逃袉挝籉U表示。納豆激酶的生產(chǎn)工藝

可以從納豆菌的發(fā)酵液中提取得到納豆激酶。由于納豆激酶是胞外酶，故可省去了細胞破碎和緩沖液抽提的步驟。具體方法如下：

（1）將購買或從納豆中分離篩選得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，4000rpm離心30min，取上清液，即為粗酶液。

（2）用硫酸銨分級沉淀的方法除去雜蛋白、多糖等。取上清液緩慢加入硫酸銨至25％飽和度，低溫過夜，4000rpm離心30min去除雜蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸銨至終飽和度為60％，低溫過夜，4000rpm離心30min除去多糖類物質(zhì)，收集沉淀，溶于緩沖液中，得到的為粗酶液。（3）粗酶液經(jīng)透析脫鹽，除去硫酸銨。（4）為了最終獲得符合要求的產(chǎn)物，將樣品進行多級層析，目的是先層析濃縮樣品和去除雜質(zhì)，再層析去除殘存雜質(zhì)、目的蛋白的多聚物或降解片段。凝膠