生物化學(xué)3核酸

生物化學(xué)第二章核酸化學(xué)重點：①核苷酸的組成②DNA的一級及空間結(jié)構(gòu)③核酸紫外吸收性質(zhì)④核酸的變性、復(fù)性與雜交。難點：①DNA的空間結(jié)構(gòu)②DNA的生物學(xué)功能核酸的組成DNA的結(jié)構(gòu)RNA的結(jié)構(gòu)與功能核酸的性質(zhì)核酸的生物功能和實踐意義一、核酸的組成成分1869Miescher從膿細胞的細胞核中分離出了一種含磷酸的有機物，當(dāng)時稱為核素（nuclein）,后稱為核酸（nucleicacid）。1952年Hershey等的實驗表明32P-DNA可進入噬菌體內(nèi)，證明DNA是遺傳物質(zhì)。1953Watson和Crick建立了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，說明了基因的結(jié)構(gòu)、信息和功能三者間的關(guān)系。1958Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則核酸的生物學(xué)功能（一）DNA是主要的遺傳物質(zhì)（二）RNA生物學(xué)功能1.參與蛋白質(zhì)的合成2.遺傳物質(zhì)3.具有生物催化劑功能4.基因表達與細胞功能的調(diào)節(jié)

核酸是一種線性大分子，包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是由相應(yīng)核苷酸聚合而成具有一定空間結(jié)構(gòu)的大分子化合物。核苷酸由堿基、糖、和磷酸所組成。脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）:遺傳信息的貯存和攜帶者，生物的主要遺傳物質(zhì)。核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）：主要參與遺傳信息的傳遞和表達過程，細胞內(nèi)的RNA主要存在于細胞質(zhì)(90%)中，少量存在于細胞核(10%)中，病毒中RNA本身就是遺傳信息的儲存者。核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）轉(zhuǎn)移RNA（transferRNA，tRNA）信使RNA（messengerRNA，mRNA）小RNA（smallRNA，sRNA）核蛋白磷酸核苷堿基戊糖蛋白質(zhì)核酸→核苷酸堿基戊糖磷酸嘌呤嘧啶RNA腺嘌呤Ade胞嘧啶Cyt核糖

H3PO4鳥嘌呤Gua尿嘧啶UraDNA腺嘌呤Ade胞嘧啶Cyt脫氧核糖鳥嘌呤Gua胸腺嘧啶Thy1．戊糖（pentose）

β-D-核糖β-D-2-脫氧核糖β-D-2-O-甲基核糖（1）嘌呤堿（purine,Pu）

腺嘌呤鳥嘌呤2．堿基（base）：又稱含氮堿

（2）嘧啶堿（pyrimidine,Py）

胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶（3）修飾堿基（modifiedbase）稀有堿基（minorbase）①互變異構(gòu)現(xiàn)象

酮式烯醇式糖的第一位碳原子與嘧啶的第一位氮原子或嘌呤的第九位氮原子以C-N糖苷鍵相連。堿基與糖環(huán)平面互相垂直。都是β糖苷鍵。3.核苷天然核苷：一般為反式構(gòu)象

修飾核苷（modifiednucleoside）：

修飾核苷包括三種情況:

（1）由修飾堿基和糖組成的核苷（2）由非修飾堿基和2-O-甲基核糖組成的核苷（3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷假尿苷（

）二氫尿嘧啶（DHU）AmCH3CH3H3Cm26GHH5HH幾種稀有核苷腺嘌呤核苷酸（AMP）

Adenosine

monophosphate脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosine

monophosphate鳥嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）HOH4.核苷酸（1）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）：

2’，3’，5’一核糖核苷酸(2′-AMP)(3′-AMP)(5′-AMP)（2）脫氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）3’，5’一脫氧核糖核苷酸Deoxyadenosine3’-monphosphate(3’-dAMP)Deoxyadenosine5’-monphosphate(5’-dAMP)（1）一般物理性質(zhì)（2）互變異構(gòu)現(xiàn)象4.2核苷酸的性質(zhì)（3）紫外吸收胞嘧啶核苷酸的解離（4）核苷酸的兩性解離和等電點核苷酸的解離曲線pK1=0.9第一磷酸基pK3=6.2第二磷酸基pK2=3.7含氮環(huán)腺嘌呤核苷酸pK1=0.7第一磷酸基pK3=6.1第二磷酸基pK2=2.4含氮環(huán)烯醇式羥基鳥嘌呤核苷酸pK1=0.8第一磷酸基pK3=6.3第二磷酸基pK2=4.5含氮環(huán)胞嘧啶核苷酸pK1=1.0第一磷酸基pK3=6.4第二磷酸基烯醇式羥基尿嘧啶核苷酸pH離子化程度可在pH2.0～5.0之間分離各種核苷酸

pH3.5時各核苷酸所帶電荷

核苷酸磷酸基電荷堿基的電荷凈電荷AMP-1+0.54-0.46GMP-1+0.05-0.95CMP-1+0.84-0.16UMP-1+0-1ATP類的高能磷酸化合物

核苷酸的重要衍生物細胞中的攜能物質(zhì)（如ATP、GTP、CTP、UTP）二、DNA的結(jié)構(gòu)55333

-5

磷酸二酯鍵（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)

5’→3’DNA一級結(jié)構(gòu)的表示法5′3′結(jié)構(gòu)式5′3′

p

p

p

pOH3′ACTG1′線條式5′

ACTGCATAGCTCGA3′字母式英國Sanger1975年加減法1977年末端終止法

美國Maxam和Gilbert1977年化學(xué)斷裂法

DNA分子中核苷酸的序列p951971年，吳瑞將引物延伸（primerextension）用于DNA測序。吳瑞發(fā)明的聯(lián)接子（linker）和銜接子（adaptor）迄今仍然是克隆DNA的常用工具他主編的《重組DNA》曾風(fēng)靡分子生物學(xué)和生物技術(shù)界。上世紀80年代后，吳瑞在水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)上有先導(dǎo)性貢獻。吳瑞（1928-2008）吳瑞在分子生物學(xué)和植物生物學(xué)等領(lǐng)域有重要貢獻。酶法（雙脫氧法、末端終止法）DNA序列分析儀：四色熒光基團標(biāo)記的dNTP提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù)1、x-光衍射分析20世紀40年代Astbury1952年M.Wilkins（二）DNA的二級結(jié)構(gòu)

從這個衍射圖可以推測出，DNA可能具有螺旋結(jié)構(gòu)，DNA分子中有0.34nm和3.4nm的周期性結(jié)構(gòu)。2、Chargaff規(guī)律1950年（1）所有生物的DNA中，A=T，G=C，A+C=G+T，且A+G=C+T。（2）DNA的堿基組成具有種的特異性。（3）DNA堿基組成沒有組織和器官的特異性。（4）年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成。DNA的雙螺旋模型特點（1）兩條反向平行的多聚核苷酸鏈形成右手螺旋。（2）堿基對鏈間堿基按A=T，G≡C堿基互補（3）堿基、糖、磷酸的位置。磷酸和脫氧核糖單位作為骨架位于外側(cè)，作為可變成分的堿基位于內(nèi)側(cè)。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行；小溝位于雙螺旋的互補鏈之間大溝位于相毗鄰的雙股之間

（4）大溝和小溝分別指雙螺旋表面凹下去的較大溝槽和較小溝槽。（5）大多數(shù)天然DNA是雙鏈DNA（dsDNA）DNA雙鏈線狀雙鏈環(huán)狀單鏈線狀：動物病毒MVM單鏈環(huán)狀：噬菌體φX174真核細胞染色體DNA噬菌體T2，T5，T7，λ，P22

E-Coli染色體DNA線粒體DNA葉綠體DNA多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA噬菌體λ和φX174的復(fù)制型（6）核苷酸序列復(fù)雜性和多樣性穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素①堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要因素）。②堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。③磷酸基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子形成離子鍵。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價值的是確認了堿基配對原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達的分子基礎(chǔ)。DNA雙螺旋的種類

當(dāng)DNA鈉鹽纖維相對濕度和鹽的種類改變時，DNA的構(gòu)象發(fā)生改變。類型結(jié)晶狀態(tài)ANa鹽，相對濕度75%時結(jié)晶BNa鹽，相對濕度92%時結(jié)晶C鋰鹽，相對濕度66%時結(jié)晶（1）B-DNA每圈螺旋10個堿基對螺距：3.32nm（2）A-DNA右手螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交（3）Z-DNA左手螺旋，外形細長。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。d(CpGpCpGpCp-Gp)與基因表達、基因調(diào)控有關(guān)

三、RNA的結(jié)構(gòu)（一）RNA的一級結(jié)構(gòu)

1．核苷酸之間的連接方式AMP、GMP、CMP、UMP通過3’、5’磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。RNA與DNA的差異

DNARNA糖脫氧核糖核糖堿基

AGCTAGCU不含稀有堿基含稀有堿基（1）轉(zhuǎn)運核糖核酸（transferRNA:tRNA）

tRNA的主要功能是在蛋白質(zhì)生物合成的過程中，起著轉(zhuǎn)運氨基酸的作用。tRNA約占細胞總RNA的10-15％，一般是由73個－95個核苷酸組成。3．幾類RNA的一級結(jié)構(gòu)

tRNAAla1965年

酵母tRNAAlatRNA一級結(jié)構(gòu)的共同點:

①Mr較?。∕r25000），沉降常數(shù)4S。②各種tRNA的鏈長很接近，一般在73～93個核苷酸之間。③tRNA分子中約20多個位置上的核苷酸是保守的。④各種tRNA的3′端為CCA；5′端大多數(shù)為pG，少數(shù)為pC。⑤tRNA含有較多的修飾成分。（2）核糖體核糖核酸（ribosomeRNA:rRNA）

rRNA是核糖體的組成成分。

核糖體是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA的復(fù)合體，是蛋白質(zhì)合成的場所。核糖體含有大約60％RNA，40％蛋白質(zhì)。rRNA的一級結(jié)構(gòu)原核生物核糖體70S50S30S5SrRNA，23SrRNA34種蛋白質(zhì)16SrRNA21種蛋白質(zhì)真核生物核糖體

80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA49種蛋白質(zhì)18SrRNA33種蛋白質(zhì)原核生物：5S、16S、23S，分別具有大約120、1540、2900個核苷酸。真核生物：5S、5.8S、18S和28S，分別具有大約120、160、1900和4700個核苷酸。S為沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient），當(dāng)用超速離心測定一個粒子的沉淀速度時，此速度與粒子的大小直徑成比例。（3）信使核糖核酸（messengerRNA,mRNA）

mRNA編碼蛋白質(zhì)中的氨基酸序列，mRNA作為一個“信使”。mRNA約占細胞總RNA的5％。mRNA的一級結(jié)構(gòu)真核生物mRNA的一級結(jié)構(gòu)可用下式表示:5′-帽子5′-非密碼區(qū)密碼區(qū)3′-非密碼區(qū)polyAAAAAAAA-OH5′

“帽子”PolyA

3′

單順反子m7G-5′ppp-N-3′p原核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點5′3′順反子順反子順反子插入順序插入順序先導(dǎo)區(qū)末端順序★由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成?！餂]有5′帽子和3′polyA。（二）RNA的二級結(jié)構(gòu)RNA中雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素主要是堿基堆積力，其次是氫鍵。1、tRNA的二級結(jié)構(gòu)★三葉草形★四臂四環(huán)酵母tRNAAla

的二級結(jié)構(gòu)DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCAAla3′5′

1980年牛心線粒體tRNAser只有63個核苷酸，沉降常數(shù)3S，缺少D環(huán)和D臂，呈二葉草型。近年來發(fā)現(xiàn)2種線蟲線粒體tRNA也不是標(biāo)準(zhǔn)的三葉草結(jié)構(gòu)。四、核酸的物理化學(xué)性質(zhì)1、核酸的一般性質(zhì)2、核酸的紫外吸收3、核酸的變性、復(fù)性及雜交1、一般性質(zhì)：分子大小、性狀、溶解度、酸堿性質(zhì)

分子大?。篋NAMr106～1010或更大性狀：DNA為白色纖維狀固體而RNA為白色粉末溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有機溶劑，微溶于水，但它們的鈉鹽在水中溶解度較大。RNAMr104～106或更大酸堿性質(zhì)DNA等電點4～4.5RNA等電點2～2.5pH小牛胸腺DNA的滴定曲線2、核酸的紫外吸收

λmax=260nm1、鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85）純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值2、含量計算260nm光吸收值為1

：50ug/mL雙螺旋DNA

或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判斷DNA是否變性在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)（增色效應(yīng)）在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)（減色效應(yīng)）摩爾吸光系數(shù)——1mol/L磷的核酸溶液在一定pH和相應(yīng)波長下，光徑為1cm時測得的光吸收值3、核酸的變性、復(fù)性及雜交(1)變性★核酸變性概念★變性因素：熱變性酸堿變性（pH小于4或大于11）射線等★變性后的理化性質(zhì)：理化性質(zhì)：紫外吸收↑粘度↓比旋光度↓生物活性：生物活性↓或喪失天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值★DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。DNA的Tm一般在82～95℃之間。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度稱為解鏈溫度（Tm）。影響DNA的Tm值的因素①DNA均一性

均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性。②G-C含量測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44③介質(zhì)中離子強度（2）復(fù)性（renaturation）

理化性質(zhì):↓比旋光度↑粘度↑高于Tm值5℃復(fù)性也稱退火生物活性得到部分恢復(fù)變性DNA在適當(dāng)（一般低于Tm20～25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)?！?/p>

DNA的濃度★

DNA片段的大小★溫度(3)分子雜交（hybridization）不同來源的單鏈核酸之間可通過堿基互補形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。用硝酸纖維素膜作為支持物進行雜交

1975年英國E.M.Southern首創(chuàng)的Southernblotting（Southern印跡）探針：作為檢測用的已知DNA序列或RNA序列的片段五、核酸生物功能和實踐