第12章 吸光光度法

第12章吸光光度法12.1概述12.2吸光光度法基本原理12.3分光光度計12.4顯色反應及影響因素12.5光度分析法的設計12.6吸光光度法的誤差12.7常用的吸光光度法12.8吸光光度法的應用吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法(spectrophotometry)，屬于分子吸收光譜分析方法基于外層電子躍遷12.1概述吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜分子光譜原子光譜12.2吸光光度法基本原理1吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長范圍X射線0.1~10nm遠紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無線電波1～1000m當光子的能量與分子的

E匹配時，就會吸收光子

E=hu=hc/la躍遷類型

價電子躍遷：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h

)順序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有機化合物的生色原理b生色團（chromophore)和助色團(auxochrome)

生色團:含有π→π*躍遷的不飽和基團助色團:含非鍵電子的雜原子基團,如-NH2,-OH,-CH3…

與生色團相連時，會使吸收峰紅移(bathochromicshift)，吸收強度增強物質的顏色吸收光顏色波長范圍(l,nm)黃綠黃橙紅紫紅紫藍綠藍藍綠紫藍綠藍藍綠綠黃綠黃橙紅400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7502物質顏色和其吸收光關系互補色吸收光譜曲線：物質在不同波長下吸收的光的強度大小。

A～l關系最大吸收波長lmax：光吸收最大處的波長3一些基本名詞和概念lmax對比度(Δl):有色化合物最大吸收波長(lMRmax)與試劑最大吸收波長(lRmax)之差Δl原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級分子振動能級分子轉動能級4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度

吸光度(absorbance)、透光率、百分透光率間的關系有：T=It/I0,T%=T×100，A=-lgT=2-lgT%朗伯定律：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律：光吸收與溶液濃度成正比當一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律數(shù)學表達：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比(transmitance)，K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質無發(fā)射、散射或光化學反應摩爾吸光系數(shù)eA=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)桑德爾(sandell)靈敏度：S當儀器檢測吸光度為0.001時，單位截面積光程內所能檢測到的吸光物質的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

推導：根據(jù)定義0.001＝εbc故bc＝0.001/ε（1）c為濃度，單位為mol/1000cm3,b為cm,bc表示單位截面積光程內的摩爾數(shù)，即mol/1000cm2，如果bc乘以被測物質的分子量M,則得單位截面積光程內被測物質的量，即桑德爾靈敏度S。S=（bc/1000）×M×106=bcM×103（μg·cm-2），將（1）的bc＝0.001/ε代入，S＝(0.001/ε)×M×103，得：S=M/ε靈敏度表示方法氯磺酚S測定鋼中的鈮50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有兩種做法：根據(jù)A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進行多組分的測定以及某些化學反應平衡常數(shù)的測定在某一波長，溶液中含有對該波長的光產(chǎn)生吸收的多種物質，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個吸光物質的吸光度之和1分光光度計的組成光源單色器樣品池檢測器讀出系統(tǒng)12.3分光光度計常用光源光源波長范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特燈1000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學手段單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)檢測器

作用：接收透射光，并將光信號轉化為電信號常用檢測器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計分光光度法與分光光度計722型分光光度計光學系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管12.4顯色反應及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高(ε>104)c.產(chǎn)物的化學組成穩(wěn)定d.化學性質穩(wěn)定e.反應和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(對比度

l>60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當?shù)姆磻可捎猩衔镌贉y定－－顯色反應1顯色反應絡合反應氧化還原反應2顯色反應類型離子締合反應成鹽反應褪色反應

Zr(IV)-偶氮胂III絡合物測定草酸吸附顯色反應

達旦黃測定Mg(II),Mg(OH)2吸附達旦黃呈紅色3顯色劑無機顯色劑:過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機顯色劑：偶氮類：偶氮胂III三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結晶紫鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟4多元絡合物混配化合物Nb-5-Br-PADAP-酒石酸V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系Mo-水楊基熒光酮-CTMAB5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變Δl

影響待測離子的存在狀態(tài)，防止沉淀

影響絡合物組成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH對苯芴酮及其絡合物的顏色影響b顯色劑的用量稍過量，處于平臺區(qū)c顯色反應時間針對不同顯色反應確定顯色時間反應快且產(chǎn)物穩(wěn)定；反應快但產(chǎn)物不穩(wěn)定；反應慢，穩(wěn)定需時間；反應慢但不穩(wěn)定d顯色反應溫度加熱可加快反應速度，導致顯色劑或產(chǎn)物分解e溶劑f干擾離子有機溶劑，提高靈敏度、顯色反應速率消除辦法：提高酸度，加入隱蔽劑，改變價態(tài)選擇合適參比選擇適當波長12.5光度分析法的設計1.選擇顯色反應2.選擇顯色劑3.優(yōu)化顯色反應條件4.選擇檢測波長5.選擇合適的濃度6.選擇參比溶液7.建立標準曲線測量條件選擇1測定波長選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性2測定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少測量誤差3參比溶液選擇儀器調零消除吸收池壁和溶液對入射光的反射扣除干擾試劑空白：加入試劑，不加試樣試樣空白：加入試樣，不加試劑（試樣有吸收）褪色空白：試樣中加入某物質，使待測組分與之作用，然后加入試劑，以此為參比。4標準曲線制作理論基礎：朗伯-比爾定律相同條件下測定不同濃度標準溶液的吸光度AA～c作圖12.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學因素：非均勻介質及化學反應吸光度測量的誤差

對朗伯-比爾定律的偏移1非單色光引起的偏移復合光由l1和l2組成，對于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復合光引起的誤差大，故在高濃度時線性關系向下彎曲。*其它光學方面的干擾

雜散光散射光反射光非平行光非均勻介質

膠體，懸浮、乳濁等對光產(chǎn)生散射，使實測吸光度增加，導致線性關系上彎2物理化學因素離解、締合、異構等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學反應顯色反應體系中的副反應影響M+nL=MLn顯色反應*其它離子可能與顯色劑反應：M′+nL=M′Ln,消耗顯色劑；*L受酸效應影響，有L-、HL+等形態(tài)存在；被測離子有絡合效應。條件穩(wěn)定常數(shù)：通常被測離子有99％以上絡合時，可以認為反應完全，此時這個式子可以判斷不同條件下顯色反應的完全程度吸光度標尺刻度不均勻3吸光度測量的誤差A＝0.434

，T＝36.8%時，測量的相對誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnTEr=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的準確度和精密度解決高(低)濃度組分(i.e.A在0.2~0.8以外)問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特點：以標準溶液作空白原理：A相對=

A=bcx-bc0=bc準確度：讀數(shù)標尺擴展,相對誤差減少,

c0愈接近cx,準確度提高愈顯著12.7常用的吸光光度法例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯酸介質中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）