DB34T 4487-2023 水禽坦布蘇病毒和星狀病毒雙重PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

發(fā)布安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局2023發(fā)布安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局2023083120230731TechnicalregulationfordoublePCRdetectionmethodofwaterfowlTembusuvirusandAstrovirus34CCSB3134安 徽 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB34/T4487—2023PCRIDB34/T4487—2023I前 言本文件按照GB/T《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由安徽省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。心、定遠(yuǎn)縣畜牧獸醫(yī)局、合肥華盟生物技術(shù)有限公司、安徽省皖西白鵝原種場(chǎng)有限公司。段倩倩、伍唯、張新。1PCR擴(kuò)增儀。臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：最大離心力17000g以上。電泳儀：電壓10-300V,電流4-400mA,功率最大75W。1PCR擴(kuò)增儀。臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：最大離心力17000g以上。電泳儀：電壓10-300V,電流4-400mA,功率最大75W。20×20-21×26cm,302nm。4 主要儀器設(shè)備星狀病毒 Astrovirus星狀病毒(Astroviruses,AstV)RNA25～35nm。5～6個(gè)突起，結(jié)構(gòu)呈星形，故稱之為星狀病毒。腸炎、腎炎及尿酸鹽沉積等癥狀，是引發(fā)雛鵝痛風(fēng)的重要原因之一。坦布蘇病毒 Tembusuvirus坦布蘇病毒(Tembusuvirus,DTMUV)屬于黃病毒科(Flauiviridae)、黃病毒屬(Flaoivirus)。坦蘇病毒病(Tembusuvirusdisease):通常會(huì)引起嚴(yán)重的產(chǎn)蛋率下隆、共濟(jì)失調(diào)，卵巢出血、發(fā)炎的現(xiàn)象。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3 術(shù)語(yǔ)和定義水禽坦布蘇病毒和星狀病毒雙重PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了水禽坦布蘇病毒和星狀病毒雙重PCR品、操作步驟、結(jié)果判定、生物安全管理及廢棄物處理。本文件適用于水禽坦布蘇病毒和星狀病毒核酸檢測(cè)。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方GB19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T1948 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則SN/T4835 實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求2樣品的采集與處理樣品采集應(yīng)按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行，無(wú)菌采集感染或病死禽類(lèi)各種組織與器官（肝臟、脾臟、腎臟）。2樣品的采集與處理樣品采集應(yīng)按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行，無(wú)菌采集感染或病死禽類(lèi)各種組織與器官（肝臟、脾臟、腎臟）。樣品處理取待檢組織樣品適量（1g)，按1:5倍（W/W)加入無(wú)菌0.1MpH7.4PBS，于滅菌并烘干的研缽或組織勻漿器中充分研磨，反復(fù)凍融3次后，4℃8000rpm/min離心20min，取上清1mL轉(zhuǎn)至無(wú)菌的1.5mL離心管中，編號(hào)備用。7 操作步驟擴(kuò)增星狀病毒（GAsTV）的引物，擴(kuò)增DNA片段大小為300bp?！嫌我铮?'-AGAAGGTGCGGAAGAGTGGTATGA-3'——下游引物：5'-GCGAAGAGTGCGTAAGAGGTTGT-3'擴(kuò)增坦布蘇病毒（DTMUV）的引物，擴(kuò)增DNA片段大小為404bp?！嫌我铮?'-CTGATGGCTTTGGTCCTGTTC-3'——下游引物：5'-ACACCTATTCTCACCACATCTAAC-3'陰性對(duì)照品：滅菌超純水。陽(yáng)性對(duì)照品：坦布蘇病毒cDNA和星狀病毒cDNA。6 引物與標(biāo)準(zhǔn)品：-20℃；-80℃微波爐。0.001g水浴鍋。微量移液器：2.5μL、10μL、20μL、200μL、1000μL。超凈工作臺(tái)。5 試劑RNA：TrizolRNA氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇：為分析純。ReactionBuffer(5dNTPRNaseInhibitor20U/μL)、RandomHexamerprimer。1×TAEA。0.1MpH7.4PBS：ADNA1％A。GB/T6682，121℃、20min，高壓蒸汽滅菌。ddH2O：雙重蒸餾水。DB34/T4487—2023RNATrizolRNA200μL1mLTrizolEP，4℃10～20min,輕輕顛倒混勻。加入200μL5min；12000rpm4℃離心15min，吸取上清于新EP加入750μL10min；12000rpm4℃離心10min，吸棄上清，留下沉淀。1mL，輕輕顛倒，洗滌管壁；12000rpm4℃離心10minEP2～3min，ddH2O，-80℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄（cDNA）PCR11μLRNA，4.0μLReactionBuffer(5×)，2.0μLdNTPMix，1.0μL反轉(zhuǎn)錄酶，1.0μLRNaseInhibitor(20U/μL)、1.0μLRandomHexamerprimer。PCR25℃10min，42℃1h，-20℃保存?zhèn)溆谩CRPCR總體積為20μL，2×TaqPlusMasterMixII(DyePlus)10μL，DTMUV和GAsTV上游引物各0.5μL，DTMUV和GAsTV下游引物各0.5uL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL添加ddH2O至20μL。PCR預(yù)變性95℃3min，變性95℃15s，退火52℃20s，延伸72℃15s，循環(huán)30次，延伸72℃5min。每次PCR均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。電泳1.0％瓊脂糖凝膠板。5μLPCR產(chǎn)物，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。加入分子量標(biāo)準(zhǔn)。90V左右，電泳30～40min。PCR片段大小。結(jié)果判定在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)300bp，404bp（見(jiàn)附錄B）。300bp404bp300bp404bp300bp404bp生物安全管理及廢棄物處理生物安全管理和廢棄物處理應(yīng)按照GB19489、NY/T1948和SN/T4835的規(guī)定執(zhí)行。34在微波爐加熱至完全融化沸騰后，加入核酸染料2μL，混勻后鋪板。4在微波爐加熱至完全融化沸騰后，加入核酸染料2μL，混勻后鋪板。A.3 0.1MPBS（pH7.4）的配制氯化鈉 8.0gNa2HPO4.12H20 2.9gKCL 0.2gKH2PO4 0.2g用滅菌超純水定容至1L，調(diào)節(jié)pH至7.4。0.4g40mLA.2 1％瓊脂糖凝膠瓊脂糖（電泳級(jí)）1×TAE附錄A（資料性試劑配制1×TAE50×TAE緩沖液50×TAE緩沖液Tris 121gNa2EDTA.2H20 18.6g冰乙酸 28.55mL滅菌超純水 定容至500mL1×TAE緩沖液于10mL50×TAE緩沖液，加入490mL滅菌超純水，混勻后即可。5星狀病毒陽(yáng)性對(duì)照