馬錢(qián)子散中馬錢(qián)子的含量測(cè)定

實(shí)訓(xùn)二十三 馬錢(qián)子散中馬錢(qián)子的含量測(cè)定一、 實(shí)訓(xùn)目的掌握薄層掃描法的一般操作步驟和技能理解外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定馬錢(qián)子含量的原理了解薄層掃描法含量測(cè)定的設(shè)計(jì)思路。二、 測(cè)定依據(jù)馬錢(qián)子散藥品標(biāo)準(zhǔn)［《中國(guó)藥典》2005年版（一部）正文部分359頁(yè)］【處方】馬錢(qián)子（砂燙）適量（含士的寧8.0g）地龍（焙黃）93.5g【含量測(cè)定】取裝量差異項(xiàng)下的本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加三氯甲烷20ml與濃氨試液1ml，輕輕搖勻，稱重，于室溫下放置24小時(shí)，再稱重，補(bǔ)足三氯甲烷減失的重量，充分振搖，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取士的寧對(duì)照品，加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（附錄IVB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液8^1和對(duì)照品溶液4日1，交叉點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯一丙酮一乙醇一濃氨試液（16：12：1：4）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。照薄層色譜法（附錄VB薄層色譜掃描法）進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)：氣=257nm，人r=300nm，測(cè)量供試品吸光度積分值與對(duì)照品吸光度積分值，計(jì)算，即得。本品按干燥品計(jì)算，每袋含馬錢(qián)子以士的寧（CHNO）計(jì)，應(yīng)為7.2?8.8mg。212222薄層色譜法［《中國(guó)藥典》2005年版（一部）附錄VB］三、 測(cè)定原理本品系由馬錢(qián)子（砂燙）和地龍（焙黃）制成的散劑，具祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)之功效，內(nèi)服可治療關(guān)節(jié)疼痛、臂痛腰痛、肢體肌肉萎縮等癥。由于馬錢(qián)子為本品主藥，其中所含士的寧既是有效成分又是毒性成分，故藥品標(biāo)準(zhǔn)以士的寧為指標(biāo)，采用薄層掃描外標(biāo)一點(diǎn)法對(duì)馬錢(qián)子含量進(jìn)行測(cè)定，并規(guī)定了嚴(yán)格的含量限度，以保證用藥的安全性和有效性。士的寧為吲哚類生物堿（圖5-37），具有堿性，溶于三氯甲烷、苯、甲醇、乙醇，難溶于水。因此樣品前處理時(shí)，采用三氯甲烷-濃氨試液浸漬提取，加入少量濃氨試液的目的在于堿化樣品中的士的寧，使其轉(zhuǎn)變成游離態(tài)生物堿，進(jìn)而溶于三氯甲烷被提取出來(lái)。此外，在展開(kāi)劑中加入一定比例濃氨試液是使展開(kāi)劑微呈堿性，以便克服硅膠的弱酸性，抑制士的寧的解離，使其斑點(diǎn)集中清晰。士的寧結(jié)構(gòu)中具有共軛體系，在紫外光區(qū)有吸收，254nm處呈現(xiàn)最大吸收，但無(wú)熒光性質(zhì)，因此在薄層色譜試驗(yàn)中采用熒光淬滅法進(jìn)行顯色和定位，即將展開(kāi)后的硅膠GF4薄層板置熒光燈下，用254nm紫外光照射，薄層板中熒光物質(zhì)發(fā)出黃綠色熒光，在此背景上，士的寧所在位置呈現(xiàn)暗藍(lán)褐色斑點(diǎn)。圖5-37士的寧結(jié)構(gòu)式測(cè)定原理：在堿性條件下，用三氯甲烷將士的寧從樣品中提取出來(lái)，經(jīng)薄層色譜分離得到其斑點(diǎn)，通過(guò)隨行展開(kāi)的對(duì)照品士的寧進(jìn)行定位。然后分別對(duì)供試品和對(duì)照品士的寧斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，測(cè)定相應(yīng)的吸光度積分值。根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法直線方程，建立供試品士的寧濃度公式，將測(cè)得的供試品、對(duì)照品吸光度積分值以及對(duì)照品濃度代入其中，即可計(jì)算出士的寧含量。四、 儀器與試劑薄層掃描儀、分析天平（感量0.0001g、0.00001g）、具塞錐形瓶、移液管、硅膠GF4薄層板、展開(kāi)缸、點(diǎn)樣器（微升毛細(xì)管或微量注射器）、熒光燈等。士的寧對(duì)照品、三氯甲烷、甲苯一丙酮一乙醇一濃氨試液（16：12：1：4上層）等。五、 實(shí)驗(yàn)步驟與內(nèi)容供試品溶液的制備在50ml具塞錐形瓶中，用分析天平（感量0.0001g）精密稱定裝量差異項(xiàng)下的本品約0.5g，稱量范圍0.4500g?0.5500g，記錄所稱重量。用移液管精密加三氯甲烷20ml與濃氨試液1ml，密塞，輕輕搖勻，分析天平（感量0.0001g）稱重，保留四位有效數(shù)字并記錄重量，于室溫下放置24小時(shí)，其間不時(shí)振搖。再用分析天平（感量0.0001g）稱重，用吸管小心滴加三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，充分振搖，常壓過(guò)濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液作為供

試品溶液。對(duì)照品溶液的制備在10ml量瓶中，用分析天平（感量0.00001g）精密稱定士的寧對(duì)照品10mg，稱量范圍0.00950g?0.01050g，記錄所稱重量。加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml含0.95?1.05mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。測(cè)定法照薄層色譜法（附錄IVB）試驗(yàn)，用微升毛細(xì)管或微量注射器吸取供試品溶液8pl和對(duì)照品溶液4日1，按外標(biāo)兩點(diǎn)法點(diǎn)樣要求，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，形成至少6個(gè)原點(diǎn)，原點(diǎn)間距不得小于8mm，故應(yīng)選用15cmX20cm規(guī)格的薄層板。以甲苯一丙酮一乙醇一濃氨試液（16：12：1：4）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)10cm左右，展開(kāi)前要充分“飽和”30分鐘。展開(kāi)完畢，取出薄層板，晾干至無(wú)展開(kāi)劑氣味。置熒光燈下，254nm紫外線照射，根據(jù)對(duì)照品斑點(diǎn)位置確定供試品色譜中士的寧斑點(diǎn)位置。照薄層色譜法（附錄VB薄層色譜掃描法）規(guī)定，分別對(duì)上述兩種斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)：人，=257nm，人r=300nm，測(cè)量供試品士的寧吸光度積分值與對(duì)照品吸光度積分值，供含量計(jì)算用。含量計(jì)算（1）根據(jù)下式求出供試品溶液中士的寧的濃度（C供mg/ml）式中C供為供試品溶液的濃度；C對(duì)為對(duì)照品溶液的濃度；A供為被供試品被測(cè)斑點(diǎn)的吸光度的積分值；A對(duì)為對(duì)照品斑點(diǎn)吸光度的積分值。（2）根據(jù)下式求出供試品中士的寧的含量（保留兩位有效數(shù)字）含量（mg/含量（mg/袋）二C供x供試品溶液體積x平均裝量取樣量【操作要點(diǎn)】供試品溶液應(yīng)平行制備兩份。展開(kāi)劑制備應(yīng)在分液漏斗中操作，各種溶劑按規(guī)定比例加入后，要充分振搖、放置，使澄清并完全分層，取上層溶液作為展開(kāi)劑。展開(kāi)劑用量要能滿足展開(kāi)和“飽和”所需。實(shí)驗(yàn)中使用的薄層板較寬，易產(chǎn)生“邊緣效應(yīng)”，影響測(cè)量工作。故展開(kāi)前應(yīng)充分“飽和”，在展開(kāi)缸內(nèi)放置與展開(kāi)缸內(nèi)徑同樣大小的濾紙并吸著展開(kāi)劑，可提高“飽和”速率，克服“邊緣效應(yīng)”。熒光淬滅法顯色定位應(yīng)在暗室或暗光處進(jìn)行。薄層板應(yīng)使用市售薄層板。掃描時(shí)應(yīng)沿展開(kāi)方向自下而上進(jìn)行掃描，不能橫向掃描。記錄取樣量、薄層色譜掃描圖、吸光度積分值、系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)和計(jì)算結(jié)果等。供試品被測(cè)斑點(diǎn)的吸光度積分值應(yīng)與對(duì)照品的接近，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量。六、 結(jié)果判斷將測(cè)試結(jié)果與藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定比較，若處于含量限度之內(nèi)則判定為符合規(guī)定。七、 實(shí)訓(xùn)思考本實(shí)驗(yàn)提取溶劑和薄層展開(kāi)劑中為什么要加入一定量濃氨試液？具有何種性質(zhì)的被測(cè)成分才可選用熒光淬滅法進(jìn)行薄層顯色定位？外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定含量時(shí)，為什么要求供試品斑點(diǎn)峰面積積分值應(yīng)與對(duì)照品斑點(diǎn)的接近？八、 實(shí)訓(xùn)測(cè)試馬錢(qián)子散中士的寧含量測(cè)定實(shí)訓(xùn)測(cè)試表（百分制）測(cè)試指標(biāo)測(cè)試內(nèi)容a觀測(cè)點(diǎn)分值評(píng)價(jià)等級(jí)ABCDE1.00.70.50.30著裝2

檢驗(yàn)依據(jù)寫(xiě)出測(cè)定依據(jù)的來(lái)源3相關(guān)知識(shí)為什么選擇士的寧作為馬錢(qián)子散含量測(cè)定的指標(biāo)？本法屬于何種含量測(cè)定方法？本法采用外標(biāo)一點(diǎn)法還是外標(biāo)兩點(diǎn)法？判定依據(jù)是什么？9先在以下括號(hào)內(nèi)寫(xiě)出操作步驟序號(hào)和名稱，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（ ）操作（ ）步驟（ ）及實(shí)（ ）60驗(yàn)（ ）（ ）（ ）（ ）結(jié)果描述2