蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組的概念由澳大利亞的科學(xué)家馬克韋爾和威廉提出，并于1994年首次在elckshichorphones發(fā)表?，F(xiàn)在把它定義為“基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì),它與基因組相對應(yīng),也是一個整體的概念”。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)則是以蛋白質(zhì)組為研究對象,從整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的一門科學(xué)。近年來,由于蛋白組學(xué)研究方法以及技術(shù)的不斷改進(jìn)和提高,使得蛋白組學(xué)的研究取得了迅猛的發(fā)展。本文對近年來蛋白組學(xué)技術(shù)的進(jìn)展及其在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用作一綜述。1蛋白組技術(shù)的進(jìn)展1.1顯微解剖相關(guān)研究進(jìn)展樣品制備是蛋白質(zhì)研究的首要步驟,目的是盡可能去除樣品中非蛋白物質(zhì),最大可能地提取全部蛋白質(zhì)。由于臨床上所取的樣品都不是由相同的實體組成,它們有著各自不同的物理和化學(xué)特性,因此,能否解決細(xì)胞的異質(zhì)性問題,將對病變細(xì)胞的蛋白質(zhì)組分析起著關(guān)鍵的作用。目前常用的樣品處理技術(shù)有液相等電聚焦、膜電泳、吸附色譜、亞細(xì)胞分級、激光捕獲顯微解剖技術(shù)(lasercapturemicrodissection,LCM)、非電荷還原劑及酶抑制劑的使用、連續(xù)多步提取方法、變形劑及表面活性劑。LCM是一種快速可靠的組織細(xì)胞分離方法,該技術(shù)能在復(fù)雜的環(huán)境中挑選出需要的細(xì)胞團(tuán),用于提取高質(zhì)量的DNA、RNA和蛋白質(zhì),從而較好地解決了組織細(xì)胞異質(zhì)性問題。因此,其特別適用于腫瘤學(xué)方面的研究。但其分離能力有限,而且由于該法處理樣品所需時間較長,對于低拷貝蛋白檢測效率略低,因此,在一定程度上限制了其在臨床快速診斷中的應(yīng)用。近年來,基于氮激光的微束切割-激光壓力彈送法技術(shù)(lasermicrobeammicrodissection-laserpressurecatapultting,LMM-LPC)和質(zhì)譜成像(imagingMS)等技術(shù)正在快速應(yīng)用于許多領(lǐng)域,包括腫瘤研究。1.2蛋白質(zhì)分離技術(shù)1.2.1蛋白質(zhì)電泳技術(shù)1.2.1.凝膠電泳檢測蛋白質(zhì)2DE的引進(jìn),奠定了平行蛋白質(zhì)分析的技術(shù)基礎(chǔ),并已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù),也是目前惟一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時進(jìn)行分離與展示的分離技術(shù),但該技術(shù)的重復(fù)性、敏感性較差,缺乏對蛋白質(zhì)點的精確定量,對一些小分子量的蛋白質(zhì)也無能為力。近年來發(fā)展起來的熒光差異雙向凝膠電泳(fluorescenttwo-dimensionaldifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)克服了以上缺點,能精確地在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)對相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,而且引進(jìn)內(nèi)標(biāo),使凝膠內(nèi)的待比較樣品對應(yīng)于內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù),可檢測到樣品間小于10%的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,統(tǒng)計學(xué)可信度達(dá)到95%以上。孫成榮等應(yīng)用2D-DIGE對一對來源于同一親本細(xì)胞,且淋巴道轉(zhuǎn)移潛能顯著不同的小鼠肝癌腹水細(xì)胞株(Hca-F和Hca-P)的基因表達(dá)進(jìn)行比較研究,發(fā)現(xiàn)Hca-F和Hca-P細(xì)胞之間163個有統(tǒng)計學(xué)差異的蛋白質(zhì)點,選取2倍以上的23個蛋白質(zhì)點進(jìn)行質(zhì)譜分析,共鑒定出17個可能與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)都能在人類組織細(xì)胞中找到同源蛋白。1.2.1.等電聚合酶ph梯度雙向電泳該技術(shù)是用固相pH梯度干膠條代替兩性電解質(zhì),加上與干膠條相配套的電泳儀進(jìn)行第一向等電聚焦,提高了電泳分辨率和結(jié)果的重復(fù)性,尤其是不同實驗室之間結(jié)果的可比性。固相pH梯度雙向電泳體系已成為蛋白質(zhì)組研究中分析復(fù)雜蛋白質(zhì)復(fù)合物的基本工具。但該技術(shù)對疏水性強(qiáng)、強(qiáng)酸強(qiáng)堿性以及具有重要功能的低豐度蛋白質(zhì)無法檢測,因而限制其應(yīng)用。1.2.1.電泳分離技術(shù)該技術(shù)又稱為高效毛細(xì)管電泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE),是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代柱式分離技術(shù)的結(jié)合,主要包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管等電聚焦和篩板SDS-毛細(xì)管電泳等。該技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)雙向凝膠電泳無法實現(xiàn)的高效、快速自動化分析,靈敏度可達(dá)10-19mol。CE/MS聯(lián)用還可用于研究差異表達(dá)蛋白的具體功能結(jié)構(gòu),對單一純品尤為適用,而對復(fù)雜樣品的分離尚不完全。此外,由于管徑太過纖細(xì),特大分子蛋白質(zhì)易受阻。該法目前仍不能在研究中被廣泛應(yīng)用,需進(jìn)一步對該技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行探索。1.2.2與質(zhì)譜相結(jié)合的應(yīng)用雙向高效液相色譜技術(shù)(2D-HPLC)是一種很好的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。其分離蛋白質(zhì)的容量比2-DE大,且操作簡單、速度快。通過與質(zhì)譜結(jié)合,其既可在常溫下分離制備水溶性物質(zhì),又具有高溫、高效、高分辨率和高靈敏度等特點,可用于很多不易揮發(fā)、難以熱分解物質(zhì)的全自動定性、定量分析,因此實際工作中常用于膜蛋白及低豐度蛋白質(zhì)的分離鑒定。不足之處在于其較難實現(xiàn)對細(xì)胞、組織全部蛋白質(zhì)的識別與鑒定。相信隨著對其方法的不斷改進(jìn),多維HPLC將成為大規(guī)模蛋白質(zhì)分離與鑒定方法之一。1.3蛋白質(zhì)的檢測樣品分離后,通過計算機(jī)圖象軟件分析,可以找到蛋白質(zhì)表達(dá)的差異點,然后進(jìn)行切割酶解,進(jìn)而進(jìn)行分析鑒定,確定其種類、組成和修飾,再搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比以進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)的信息。1.3.1質(zhì)量分析技術(shù)1.3.1.其他普通成分檢測指標(biāo)即蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中比較理想的技術(shù)平臺。SELDI技術(shù)是一種包含層析與質(zhì)譜的特殊蛋白質(zhì)芯片技術(shù),綜合了芯片微陣列與質(zhì)譜技術(shù)兩者的優(yōu)點,具有快速、操作簡便、樣品用量少、靈敏度高以及對多樣品的平行檢測等特征,可以直接檢測未經(jīng)處理的樣品,如血液、尿液、關(guān)節(jié)腔液等,還可分析疏水蛋白質(zhì)特別是膜蛋白質(zhì)、pI值過高或過低的蛋白質(zhì)以及低分子量的蛋白質(zhì)等,適合大規(guī)模篩選疾病相關(guān)生物標(biāo)志物以及對腫瘤的早期檢測和風(fēng)險評估都有潛在的應(yīng)用前景[22~24]。若將正常人樣本的圖譜信息同某種疾病患者比較就有望發(fā)現(xiàn)新的疾病相關(guān)蛋白質(zhì)。Ali等通過SELDI-TOF-MS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)荷質(zhì)比為7558.9Da和15103.0Da蛋白質(zhì)篩選早期肺癌患者及高危人群具有較高的特異性及敏感性。但在使用過程也發(fā)現(xiàn)一些問題,如圖譜的峰高和蛋白質(zhì)濃度之間的關(guān)系并非都是線性的,檢測過程中諸多因素控制不一等。1.3.1.超微量分析技術(shù)ESI-MS常用于鑒定復(fù)雜肽混合物(如混合蛋白溶液酶切產(chǎn)物或SDS膠上混合蛋白質(zhì)條帶鑒定),由于其常具有串聯(lián)質(zhì)譜功能,因此得到的鑒定結(jié)果更為可靠。ESI聯(lián)合nano探針注射和(或)高效毛細(xì)管液相色譜分離技術(shù)(CLC-ESI-MS)可獲得極低微量的肽的序列信息,可實現(xiàn)蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)成分的超微量分析。四極桿飛行時間質(zhì)譜(ESI-TOF-MS)技術(shù),對蛋白質(zhì)微測序和氨基酸殘基的修飾分析有著重要的研究價值,其較單極四極質(zhì)譜儀或離子阱質(zhì)譜儀有更寬的質(zhì)量范圍和更高的質(zhì)量準(zhǔn)確度。而混合型的四極桿飛行時間質(zhì)譜儀稱之為Q-TOF或QqTOF,其質(zhì)量準(zhǔn)確度優(yōu)于5ppm,應(yīng)用nanoESI-MS/MS(納電噴霧質(zhì)譜技術(shù))時,靈敏度可低達(dá)fmol水平。Carvalho等用ESI-MS及SELDI-TOF-MS技術(shù)研究了30例Hodgkin’s患者與正常人血清,發(fā)現(xiàn)了8個有意義的蛋白質(zhì)峰,其中4個含量上調(diào),4個含量下調(diào),提出此方法可以作為Hodgkin’s早期診斷的依據(jù)。但該質(zhì)譜技術(shù)不宜進(jìn)行N-端和C-端序列鑒定,要完全鑒定某蛋白質(zhì)尚需結(jié)合傳統(tǒng)的鑒定技術(shù)如氨基酸微測序(Edman降解法)、氨基酸組成分析等以了解N-端和c-端序列信息。1.3.1.maldi-tof-ms肽質(zhì)量指紋圖譜分析MALDI利用激光脈沖從干燥結(jié)晶的基質(zhì)中氣化被分析物并使之帶電,由于多肽離子帶單一電荷,所以蛋白質(zhì)飛行時間的長短僅與質(zhì)荷比成反比。最終,探測器得到的蛋白質(zhì)質(zhì)荷比可同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,以鑒定該蛋白質(zhì)。MALDI-TOF-MS普遍用于肽質(zhì)量指紋圖譜分析,此法方便、快速(分析時間為3~5分鐘)、靈敏(可達(dá)fmol水平),肽質(zhì)量檢測可準(zhǔn)確到50ppm,是目前蛋白質(zhì)組研究中最常用的膠上蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。但是,MALDI技術(shù)不能完成蛋白水解液中肽的測序,除非在分析前將肽衍生化。McCaw等采用MALDI技術(shù)研究了11例有B細(xì)胞淋巴瘤犬的淋巴結(jié)和13例正常犬的淋巴結(jié),共發(fā)現(xiàn)了93個有意義的蛋白質(zhì)峰,其中幾個異常表達(dá)的蛋白質(zhì)分別出現(xiàn)上調(diào)及下調(diào),從而認(rèn)為這些蛋白也許可以作為淋巴瘤的早期診斷標(biāo)志。1.3.2串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)ICAT技術(shù)目前已成為蛋白質(zhì)組研究技術(shù)中的核心技術(shù)之一。它是在質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種定量質(zhì)譜法,能夠精確地分析不同樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異,從而使蛋白質(zhì)組學(xué)真正成為一種差異顯示技術(shù)。此技術(shù)是用具有不同質(zhì)量的小分子試劑ICAT去標(biāo)記處于不同狀態(tài)下的細(xì)胞中的蛋白質(zhì),再利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),能非常準(zhǔn)確地比較出兩份樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的不同。此法可以對混合樣品直接測試;能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質(zhì),尤其是疏水性蛋白等;還可以快速找出疾病相關(guān)蛋白質(zhì)及生物標(biāo)志分子,故可用于快速臨床診斷,具有巨大應(yīng)用價值。Jennifer等采用該技術(shù)比較順鉑敏感細(xì)胞系(IGOV-1)和順鉑耐藥細(xì)胞系(IGOV-1/CP),發(fā)現(xiàn)IGOV-1/CP中細(xì)胞識別分子、S100蛋白家族成員、結(jié)合黏附分子和ATP結(jié)合蛋白異常表達(dá)增高,IGOV-1中肝細(xì)胞胞生長因子抑制劑1B和程序化細(xì)胞死亡蛋白6異常表達(dá)增高。ICAT技術(shù)的缺點是只能對含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,而不能測定其它的蛋白質(zhì)和多肽,而且樣品從處理到最后的質(zhì)譜分析所經(jīng)過的步驟較多,對精確的定量分析有影響。1.3.3氨基酸的組份特征此法可提供蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)信息,根據(jù)不同蛋白質(zhì)具有特定的氨基酸組份的特征來鑒定蛋白質(zhì)。該法經(jīng)濟(jì),但速度較慢、靈敏度低,所需蛋白質(zhì)或肽的量較大,酸性水解不徹底或部分降解時可產(chǎn)生氨基酸變異。1.4蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)主要涉及蛋白質(zhì)組研究結(jié)果的公布、查詢及應(yīng)用等,是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少的一部分。將差異蛋白質(zhì)位點進(jìn)行鑒定,可分析已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能,亦可豐富現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,進(jìn)而展開功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。2領(lǐng)域的創(chuàng)新創(chuàng)造近年來,中醫(yī)學(xué)從經(jīng)驗醫(yī)學(xué)向現(xiàn)代醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)變,是醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的一大創(chuàng)新。蛋白質(zhì)組學(xué)和中醫(yī)認(rèn)識疾病的整體觀有一定的趨同性,利用其理論與方法探索中醫(yī)學(xué)證候本質(zhì)以及中藥藥效的機(jī)制都可能成為中醫(yī)藥理論研究的突破口。2.1中醫(yī)證候?qū)W研究蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化能體現(xiàn)機(jī)體的動態(tài)演變,證候宏觀層次上的微觀辨證,是整體觀的重要發(fā)展和深化。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),通過對同一疾病不同證候或同一證候不同疾病的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異和功能的研究,結(jié)合生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)比較分析,就可以建立疾病證型相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜和數(shù)據(jù)庫。通過對中醫(yī)證候產(chǎn)生前后蛋白質(zhì)組學(xué)的研究來探索中醫(yī)證型產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)并了解其變化規(guī)律,研究證候與蛋白質(zhì)組學(xué)之間的關(guān)系,建立“證候—蛋白質(zhì)表達(dá)譜”,以此來揭示中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵,進(jìn)而為中醫(yī)辨證的客觀化提供依據(jù)和方法。有學(xué)者對證候的蛋白質(zhì)組基礎(chǔ)開展了初步的實驗研究。盧德趙等應(yīng)用凝膠內(nèi)差異顯示電泳技術(shù)研究腎陽虛大鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組,并從肝線粒體蛋白質(zhì)組角度闡述腎陽虛與能量代謝的關(guān)系。結(jié)果表明腎陽虛動物能量代謝相關(guān)酶的變化與腎陽虛的臨床虛寒癥狀有關(guān)。吳紅金等應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)觀察了冠心病血瘀證病人與正常人血漿中的蛋白質(zhì)變化,發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證病人血漿與正常人相比有3個蛋白質(zhì)下調(diào)和6個蛋白質(zhì)上調(diào),并提出纖維蛋白原端粒酶有望作為診斷冠心病血瘀證的標(biāo)志物。2.2對中藥復(fù)方作用機(jī)制的探討中藥成分復(fù)雜,復(fù)方更是如此,都是一個復(fù)雜的化學(xué)成分庫。因此,通過蛋白組學(xué)技術(shù)和策略,以蛋白質(zhì)為靶點,分析復(fù)方及各種搭配拆分后所表達(dá)的蛋白質(zhì)組的差異、鑒定其中發(fā)生相應(yīng)變化的蛋白質(zhì),并通過對治則、治法理論實質(zhì)的探討,有可能對中藥復(fù)方的作用機(jī)制取得突破性進(jìn)展,從而極大地促進(jìn)我國中醫(yī)藥領(lǐng)域生物工程制藥的發(fā)展,加速中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。吳偉康等探討了四逆湯保護(hù)缺血心肌的相關(guān)蛋白改變譜,發(fā)現(xiàn)四逆湯可以影響大鼠缺血心肌的多個蛋白質(zhì)點的表達(dá),經(jīng)質(zhì)譜鑒定,這些差異表達(dá)的蛋白與心肌的能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)能、心肌細(xì)胞修復(fù)和抗氧