uplc-msms法同時(shí)測(cè)定注射用辛芍凍干粉針中8種成分的含量

uplc-msms法同時(shí)測(cè)定注射用辛芍凍干粉針中8種成分的含量

射箭注釋（冷凍干粉針）是用現(xiàn)代紅茶、燈火以及冷冷凍干燥法從現(xiàn)代紅茶中提取出來的中藥。具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的功效，主要用于中風(fēng)和血瘀阻絡(luò)證的臨床治療。能迅速改善腦缺血?jiǎng)游锏陌Y狀,對(duì)腦缺血性大鼠及小鼠有明顯保護(hù)作用;增加大鼠腦血流,改善缺血大鼠腦微循環(huán)［1－4］。多成分含量測(cè)定方法是中藥現(xiàn)代化質(zhì)量控制的重要手段和趨勢(shì)。液質(zhì)聯(lián)用法由于專屬性強(qiáng)、靈敏度高,已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制研究中［5－6］。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量,確保本品的臨床療效,采用UPLC-MS/MS法建立了注射用辛芍(凍干粉針)中7個(gè)主要成分的含量測(cè)定方法,該方法操作簡(jiǎn)便,快速靈敏,重現(xiàn)性好,為全面準(zhǔn)確地控制注射用辛芍(凍干粉針)的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。ACQUITYTM系統(tǒng)超高液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1質(zhì)譜工作站,美國(guó)Waters公司)。沒食子酸(批號(hào):110831-200803)、芍藥苷(批號(hào):110736-200934)和野黃芩苷(批號(hào):110842-201106)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;氧化芍藥苷(批號(hào):20120310)、芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào):S37-100126)、燈盞甲素(批號(hào):20120706)和苯甲酰芍藥苷(批號(hào):20120321)對(duì)照品購(gòu)自中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心;注射用辛芍(凍干粉針,貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,規(guī)格:200mg/支,批號(hào):20100612,20100620,20100703)。乙腈(德國(guó)Merck公司)、甲酸(美國(guó)Tedia公司)為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。方法和結(jié)果1流動(dòng)相及流場(chǎng)色譜柱為WATERSACQUITYBEHC18柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液,線性梯度洗脫程序見表1;流速為0.35mL·min－1;柱溫為45℃;進(jìn)樣量為1μL。2正負(fù)離子同步檢測(cè)離子源電噴霧電離源(ESI);毛細(xì)管電壓3.0kV;離子源溫度120℃;去溶劑氣N2,流速650L·h－1;去溶劑氣溫度350℃;離子源溫度120℃;碰撞氣Ar,流速0.18mL·min－1;多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行正負(fù)離子同步檢測(cè);監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為:沒食子酸,m/z(-)168.9→125.0;氧化芍藥苷,m/z(-)495.3→136.9;芍藥內(nèi)酯苷,m/z(+)481.3→105.0;芍藥苷,m/z(-)525.2→121.0;野黃芩苷,m/z(+)463.1→287.1;燈盞甲素,m/z(+)447.2→271.1;苯甲酰芍藥苷,m/z(-)583.3→120.9。3對(duì)照品溶液的制備精密稱取氧化芍藥苷對(duì)照品6.17mg、燈盞甲素對(duì)照品2.08mg、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品10.04mg,置50mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得混合對(duì)照品溶液A;精密稱取沒食子酸對(duì)照品6.37mg、芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品5.06mg、芍藥苷對(duì)照品15.63mg、野黃芩苷對(duì)照品10.42mg,置100mL量瓶中,精密加入混合對(duì)照品溶液A10mL置量瓶,加甲醇稀釋至刻度,即得混合對(duì)照品溶液B。4供試品溶液制備取本品內(nèi)容物0.1g,精密稱定,置100mL量瓶中,加水使溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密吸取該液5mL,置50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,用0.22μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作供試品溶液。5測(cè)定化合物與對(duì)照品溶液的保留時(shí)間精密吸取混合對(duì)照品溶液B、供試品溶液各1μL,分別進(jìn)樣,結(jié)果見圖1。供試品溶液中被測(cè)定化合物與7個(gè)對(duì)照品的保留時(shí)間相同。比較被測(cè)定成分和對(duì)照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖,兩者一致,表明本法專屬性良好。6儀器精密度與重復(fù)性6.1線性關(guān)系考察精密量取混合對(duì)照品溶液B1,2,4,6,8,10mL分別置于6個(gè)25mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,制得6個(gè)系列濃度線性工作液,分別進(jìn)樣測(cè)定。以色譜峰峰面積(A)為縱坐標(biāo),以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得各被測(cè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限(LOQ)和檢測(cè)限(LOD),見表2。6.2精密度取混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、野黃芩苷、燈盞甲素和苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD(n=6)為2.69%,1.79%,3.07%,2.85%,3.71%,2.13%,3.93%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。6.3重復(fù)性精密稱取同一批注射用辛芍(凍干粉針)(批號(hào):20100612),共6份,按“供試品溶液”項(xiàng)下方法操作,在上述色譜條件下進(jìn)樣,沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、野黃芩苷、燈盞甲素和苯甲酰芍藥苷的平均含量(n=6)分別為9.27%,1.22%,7.32%,23.71%,16.39%,0.39%,3.66%;RSD(n=6)分別為3.23%,2.14%,3.82%,1.73%,3.01%,2.59%,1.35%。結(jié)果表明,重復(fù)性良好。6.4穩(wěn)定性取同一批注射用辛芍(凍干粉針)樣品(批號(hào):20100612),分別在0,1,2,4,8,12h進(jìn)樣分析,測(cè)得沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、野黃芩苷、燈盞甲素和苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD(n=6)分別為2.43%,3.66%,2.59%,3.87%,3.03%,4.17%,3.23%。結(jié)果表明,供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。7注射用辛嫌犯凍干粉針的理化性質(zhì)測(cè)定隨著色譜技術(shù)的發(fā)展和儀器性能的提高,多成分含量測(cè)定方法已成為中藥現(xiàn)代化質(zhì)量控制的重要手段和趨勢(shì)［7－8］,與現(xiàn)行的單一指標(biāo)成分定性、定量檢測(cè)的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法相比,可有效地量化檢測(cè)中藥各化學(xué)成分的綜合信息,突出了中藥整體性的特點(diǎn),更為科學(xué)合理。本研究采用UPLC-MS/MS建立了注射用辛芍(凍干粉針)多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法,在4min內(nèi)同時(shí)測(cè)定了制劑中7個(gè)含量相對(duì)較高的指標(biāo)成分,簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,并實(shí)現(xiàn)了對(duì)藥物成分整體把握,可較為全面地控制注射用辛芍(凍干粉針)質(zhì)量。為加強(qiáng)中藥、天然藥物注射劑的質(zhì)量管理,促進(jìn)中藥、天然藥物研制工作進(jìn)一步規(guī)范化、科學(xué)化和標(biāo)準(zhǔn)化,2008年12月國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局正式出臺(tái)了《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》,規(guī)定注射劑中所含成分應(yīng)基本清楚,多成分制成的注射劑,總固體中結(jié)構(gòu)明確成分的含量應(yīng)不少于60%。本研究對(duì)3個(gè)批次的注射用辛芍(凍干粉針)中試樣品進(jìn)行了測(cè)定,其可測(cè)成分含量在61.24%~63.47%之間,基本符合《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》,為注射用辛芍(凍干粉針的研究開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。加樣回收率及rsd6.5回收率精密稱取6份已知含量的注射用辛芍(凍干粉針)樣品(批號(hào):20100612)約0.05g,分別精密加入0.563mg·mL-1沒食子酸、0.084mg·mL-1氧化芍藥苷、0.437mg·mL-1芍藥內(nèi)酯苷、1.437mg·mL-1芍藥苷、1.003mg·m