下丘腦室旁核微量注射ghrelin對大鼠胃運動及胃電活動的影響

下丘腦室旁核微量注射ghrelin對大鼠胃運動及胃電活動的影響

作為一種新發(fā)現(xiàn)的腦腸苷，ghrolin是促進(jìn)下肢分泌受體（ghs-r）的內(nèi)源性配體，存在于胃內(nèi)傷細(xì)胞、中風(fēng)、腺體垂、干預(yù)、心臟和其他外源性組織中。GHS-R廣泛分布于腦及外周組織。在鼠腦,GHS-R主要位于腺垂體及下丘腦多個核團如室旁核(PVN)、弓狀核等。Ghrelin與GHS-R結(jié)合后會產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng),如刺激生長激素釋放、增加食欲、調(diào)節(jié)能量代謝等。Ghrelin對胃運動、胃電活動的調(diào)控則報道較少。外周或側(cè)腦室給予ghrelin可增強胃十二指腸動力。但目前尚缺乏神經(jīng)核團內(nèi)ghrelin對胃功能活動調(diào)控的資料。PVN是調(diào)控胃功能的重要核團,ghrelin及其受體GHS-R在PVN內(nèi)的大量分布,提示PVN內(nèi)ghrelin對胃功能的調(diào)節(jié)可能具有重要作用。為此,我們采用核團微量注射、應(yīng)力傳感器引導(dǎo)胃運動及銀絲電極引導(dǎo)胃電等方法,觀察了PVN內(nèi)ghrelin對清醒大鼠胃運動及胃電活動的影響,并就其作用的自主神經(jīng)機制進(jìn)行初步探討。1材料和方法1.1實驗動物及儀器選用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,體重250~350g,由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。Ghrelin,心得安(SigmaCo.USA);硫酸阿托品(上海第十制藥廠);酚妥拉明(Ciba-GeigyLimitedBasle,Switzerland)。1.2動物模型的制備1.2.1胃竇腹和雙極銀絲電極縫貼大鼠術(shù)前禁食18h,自由飲水。8%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉,消毒條件下開腹,距幽門0.3cm處沿環(huán)行肌方向分別將應(yīng)力傳感器及雙極銀絲電極縫貼于胃竇腹側(cè)面和背側(cè)面漿膜,導(dǎo)線經(jīng)皮下引至頸部固定。1.2.2牙托水、細(xì)銅絲固定在腦立體定位儀引導(dǎo)下,參照Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜,無菌條件下置不銹鋼套管(長25mm,外徑0.7mm,內(nèi)徑0.4mm)于一側(cè)PVN(前囟后1.5~1.8mm,旁開0.2~0.4mm,顱骨表面下5.9~6.3mm,門齒根部低于耳間線3.3mm),以針灸針(長25mm,直徑0.35mm)為套管內(nèi)芯,用502膠、牙托粉、牙托水及細(xì)銅絲固定。1.2.3靜脈壓脈疾病消毒條件下于右頸靜脈植入插管,內(nèi)充肝素(1×105U/L),導(dǎo)管經(jīng)皮下引至頸部固定。1.2.4去動脈間之感染開腹后,在距賁門5mm處的食管前后壁,切斷迷走神經(jīng)前、后支。在腹腔動脈、腹主動脈及腸系膜上動脈之間可見灰白色的交感神經(jīng)節(jié),用有齒眼科鑷鈍性分離并去除之。假手術(shù)組僅開腹后暴露迷走神經(jīng)或交感神經(jīng)節(jié)。1.2.5術(shù)后處理術(shù)后動物單獨喂養(yǎng),每天腹腔給予青霉素8萬U預(yù)防感染,術(shù)后3~5天動物恢復(fù)、飲食正常后進(jìn)行實驗觀察。1.3maclus生物信號記錄大鼠禁食18h,自由飲水。將清醒動物置于特制鼠籠內(nèi),將應(yīng)力傳感器及銀絲電極導(dǎo)線分別連接于ML110橋式放大器和ML132生物電放大器,通過MacLab生物信號記錄系統(tǒng)(ADInstrumentPtyLtd.Australia)記錄胃運動、胃電活動(胃運動:量程1mV、濾波20Hz。胃電快波:時間常數(shù)0.03s、濾波30Hz。胃電慢波:時間常數(shù)1s、濾波10Hz)。1.4外注射,機注射微量注射器以硅膠管與不銹鋼內(nèi)套管相連(外徑0.30mm,長度27mm),吸取待注射藥物后將內(nèi)套管輕插入外套管,其尖端伸出2mm進(jìn)入核團,3min內(nèi)緩慢注射完畢,留針3min。1.5pvn微量注射所有動物均隨機分組,按以下步驟進(jìn)行實驗觀察。①同步記錄5只大鼠胃運動和胃電活動1h,觀察正常胃運動及胃電活動。②大鼠分為5組,每組5~7只:實驗組(4組)PVN內(nèi)分別微量注射ghrelin0.03、0.06、0.15、0.3nmol各0.5μl,對照組PVN微量注射生理鹽水0.5μl。③大鼠分為4組,每組5只:迷走神經(jīng)假切斷組、迷走神經(jīng)切斷組、交感神經(jīng)節(jié)假摘除組、交感神經(jīng)節(jié)摘除組。每組均于PVN內(nèi)微量注射ghrelin0.3nmol/0.5μl。④大鼠隨機分為4組,每組5~6只:分別經(jīng)頸靜脈注射0.5ml生理鹽水、阿托品(0.5mg/kg)、心得安(5mg/kg)及酚妥拉明(2mg/kg),3min后PVN內(nèi)微量注射ghrelin(0.3nmol/0.5μl)。1.6冰液切片組實驗結(jié)束后,經(jīng)套管向PVN內(nèi)注入0.5μl2%滂胺天藍(lán)。麻醉后經(jīng)左心室-升主動脈灌注固定后行50μm連續(xù)冠狀冰凍切片。采用中性紅染色法,觀察腦片內(nèi)套管軌跡,確定注射部位,定位不準(zhǔn)者棄去不用。1.7統(tǒng)計學(xué)方法:符合以下四種主要利用MacLab系統(tǒng)的Chart軟件,計算注射藥物前后10min的胃運動及胃電(包括快波、慢波)幅度或頻率的變化率。公式為:給藥后幅度或頻率?給藥前幅度或頻率給藥前幅度或頻率×100％給藥后幅度或頻率-給藥前幅度或頻率給藥前幅度或頻率×100％實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用完全隨機設(shè)計方差分析方法(ANOVA),多個實驗組與一個對照組比較用最小顯著差法(LSD),多個實驗組之間比較用q檢驗(Newman-Keulstest);兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2pvn對grt-pcr胃電等重要影響因素的作用2.1正常大鼠胃運動及胃電活動正常清醒大鼠胃運動幅度為(8.25±2.93)g,頻率為(4.98±0.43)Hz;胃電快波幅度為(84.06±27.29)μV,胃電慢波幅度為(0.44±0.13)mV,胃電的頻率同胃運動一致。胃電慢波呈雙相,胃電快波成簇出現(xiàn),負(fù)載于慢波之上;胃運動與胃電活動具有同步關(guān)系,胃運動在時程上約出現(xiàn)在胃電活動后2s。2.2PVN內(nèi)微量注射ghrelin對大鼠胃運動及胃電活動的影響PVN分別微量注射ghrelin0.03、0.06nmol后,胃竇運動幅度及胃電快波和慢波的幅度有輕度增加趨勢,但與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而PVN注射0.15、0.3nmolghrelin后,胃運動及胃電幅度呈劑量依賴性增強,且以0.3nmol組最為顯著(P<0.01),胃運動及胃電快波和慢波的幅度變化率分別為(68.76±17.00)%、(57.04±17.10)%、(63.20±19.59)%;藥物劑量對胃運動頻率無明顯影響(P>0.05)(圖1、2)。2.3迷走、交感神經(jīng)在PVN內(nèi)注射ghrelin對大鼠胃運動及胃電活動調(diào)控中的作用在迷走神經(jīng)假切斷組,PVN注射0.3nmolghrelin后,胃運動及胃電快波和慢波的幅度分別增強了(60.62±20.14)%、(51.40±14.66)%、(42.30±11.11)%;迷走神經(jīng)切斷后,該效應(yīng)被完全消除(P<0.01),胃運動及胃電的幅度變化率降至(5.50±8.49)%、(3.46±8.23)%、(5.26±9.17)%。然而,交感神經(jīng)節(jié)摘除并不能阻斷PVN注射ghrelin對胃運動及胃電活動的興奮效應(yīng)(P>0.05)(圖3)。2.4頸靜脈注射外周受體阻斷劑后,PVN內(nèi)注射ghrelin對大鼠胃運動及胃電活動的影響經(jīng)頸靜脈注射生理鹽水后,PVN微量注射ghrelin0.3nmol,胃運動和胃電幅度明顯增強。經(jīng)頸靜脈分別注射心得安、酚妥拉明后并不能阻斷該效應(yīng)(P>0.05);而經(jīng)頸靜脈注射阿托品后,PVN微量注射ghrelin后并不能引起胃運動及胃電幅度的增強,而是降至(-30.42±6.72)%、(-23.10±7.94)%、(-20.70±6.87)%(圖4)。3pvn內(nèi)grtelin胃運動和胃電活動的調(diào)控作用胃電慢波是在靜息膜電位基礎(chǔ)上發(fā)生的緩慢自動除極的節(jié)律性傳導(dǎo)波,決定胃平滑肌的收縮節(jié)律;胃電快波即胃平滑肌的動作電位,發(fā)生在慢波的基礎(chǔ)上,可觸發(fā)平滑肌的收縮,其振幅和時程與胃運動的幅度和時程呈正相關(guān)。本實驗觀察到,胃竇蠕動波的頻率與胃電慢波節(jié)律一致,胃電快波成簇發(fā)生,負(fù)載于每個慢波之上,胃運動幅度及胃電快、慢波幅度同步變化,胃電活動的增強可引起胃運動的增強。PVN對生理及應(yīng)激狀態(tài)下的胃酸分泌、胃運動、胃電活動和各種病因所致的胃黏膜損傷具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。Ghrelin及其受體GHS-R在PVN內(nèi)的大量分布,提示PVN內(nèi)ghrelin對胃功能的調(diào)節(jié)可能具有重要的作用。最近的資料發(fā)現(xiàn)腹腔注射ghrelin在使大鼠攝食增加的同時,可使PVN中c-Fos蛋白表達(dá)增強;PVN內(nèi)微量注射ghrelin使大鼠攝食增加;ghrelin和胃動素具高度結(jié)構(gòu)同源性,而PVN內(nèi)注射胃動素可增強大鼠胃運動。這些均提示我們,ghrelin可否作用于PVN而影響胃運動和胃電活動?我們觀察到,PVN內(nèi)注射0.15、0.3nmolghrelin后,胃運動和胃電(包括快波、慢波)幅度呈劑量依賴性增強。這表明PVN內(nèi)ghrelin對胃運動和胃電活動具有興奮性作用。Gherlin的受體GHS-R是一種G蛋白耦聯(lián)受體,分為Ia和Ib兩型。在鼠腦,GHS1a-R除了腺垂體,主要分布下丘腦的多個核團,PVN是GHS1a-RmRNA表達(dá)最密的核團之一,而GHS1b-R在腦內(nèi)的分布遠(yuǎn)較GHS1a-R局限。我們推測,PVN內(nèi)ghrelin對胃運動及胃電活動的調(diào)控作用,可能是通過作用于PVN內(nèi)神經(jīng)元上的GHS1a-R而實現(xiàn)的。Ghrelin在血-腦屏障轉(zhuǎn)運的程度和方向取決于其翻譯后辛?；Y(jié)構(gòu),ghrelin很少經(jīng)血-腦屏障轉(zhuǎn)運,而去辛酰基化ghrelin可一過性地通過血-腦屏障;并且ghrelin是一種大分子多肽,因而可以排除ghrelin通過血-腦屏障進(jìn)入外周進(jìn)行作用的可能。中樞內(nèi)ghrelin可引起血中生長激素水平升高,然而尚沒有生長激素對胃運動功能調(diào)控的報道,故認(rèn)為PVN內(nèi)ghrelin對胃運動和胃電活動的作用可能與生長激素的分泌無關(guān)。唐明等觀察到,側(cè)腦室或下丘腦腹內(nèi)側(cè)核注射胃動素可增強胃運動,而對收縮頻率無影響,我們也注意到,PVN內(nèi)注射ghrelin后胃運動頻率無明顯變化,其胃內(nèi)機制有待于進(jìn)一步研究。我們還初步探討了PVN內(nèi)微量注射ghrelin對胃運動及胃電活動影響的外周神經(jīng)機制。除腸神經(jīng)系統(tǒng)外,胃運動及胃電活動主要受到自主神經(jīng)系統(tǒng)的支配,包括交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)。交感神經(jīng)為腎上腺能纖維,末梢釋放去甲腎上腺素,通過α、β受體抑制胃運動和胃電活動。迷走神經(jīng)主要為膽堿能纖維,末梢釋放乙酰膽堿,通過M受體使胃運動增強;此外,迷走神經(jīng)還含有少量非膽堿能非腎上腺素能纖維,末梢主要釋放肽類遞質(zhì),對胃具有興奮性或抑制性效應(yīng)。本實驗觀察到,交感神經(jīng)節(jié)摘除或靜脈分別給予腎上腺素α受體阻斷劑酚妥拉明和β受體阻斷劑