大鼠下丘腦室旁核微量注射a1a2受體阻滯劑對腎側感系統(tǒng)的影響

大鼠下丘腦室旁核微量注射a1a2受體阻滯劑對腎側感系統(tǒng)的影響

據(jù)統(tǒng)計，心跳次數(shù)（hf）的年死亡率為10%，是65歲以上老年人住院的主要原因。心衰的確切病因至今仍不十分明確,大量研究結果顯示心衰時循環(huán)內分泌激活,主要是腎素-血管緊張素(angiotensin,Ang)-醛固酮系統(tǒng)的激活可加速心力衰竭的惡化。交感神經(jīng)興奮增強是慢性心衰的重要病理特征,其可導致外周血管阻力的增加,增加心臟的后負荷,腎上腺皮質醛固酮釋放增加,水鈉潴留,從而增加心臟的前負荷。因此,降低心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)的活性可以明顯降低心衰的死亡率。據(jù)相關文獻報道,阻斷腦內血管緊張素系統(tǒng)的活性能導致慢性心衰交感神經(jīng)興奮性顯著降低。下丘腦室旁核是心血管系統(tǒng)功能調節(jié)的重要區(qū)域,其調節(jié)了交感神經(jīng)活動的輸出,它與大腦其它神經(jīng)核團存在密切聯(lián)系,包括延髓頭端腹外側區(qū)(rostralventrolateralmedulla,RVLM)、孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)、腦橋的藍斑核(locuscoeruleus,LC)等,這些區(qū)域對心血管系統(tǒng)起著重要的調節(jié)作用。本研究制作大鼠心梗后心衰模型,后腹膜途徑尋找腎交感神經(jīng),利用AngⅡ-1型(angiotensinⅡtype1,AT1)和2型(angiotensiⅡtype2,AT2)受體阻滯劑微量注射于下丘腦室旁核,記錄心率、血壓和腎交感神經(jīng)的活性,探討慢性心衰的中樞調控機制。材料和方法1sd大鼠單次給藥后hfat1和shamveh檢測選用SD大鼠,雄性,體重180-220g,由南通大學實驗動物中心提供。實驗室分籠飼養(yǎng),予以標準鼠糧和自來水,保持籠內通風干燥,室溫18-22℃。SD大鼠隨機分為2大組:手術組(HFAT1組、HFAT2組、HFVeh組)和假手術組(shamAT1組,shamAT2組、shamVeh組)。4周后采用Stoelting大鼠腦立體定位儀進行定位,POWERLAB8/30系統(tǒng)采集信號(Adinstrument)系統(tǒng)記錄心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電信號。2溶液的配制AT1受體阻滯劑(L-158809)和AT2受體阻滯劑(PD123319)均購自Sigma,用生理鹽水溶解、配制為0.1mol/L的溶液。人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)[pH7.4,含有(mmol/L):NaCl130,KCl2.99,CaCl20.98,MgCl2·6H2O0.80,NaHCO325,Na2HPO4·12H2O0.039,Na2HPO4·2H2O0.46],-20℃凍存?zhèn)溆谩?腰椎開枝形傳統(tǒng)冠脈結扎誘導慢性心衰動物模型:SD大鼠在水合氯醛麻醉下仰位固定于手術臺,自左側3-4肋間開胸,暴露心臟,于肺動脈圓錐及左心房之間找出冠脈左前降支,以0號線立即結扎冠脈,迅速關閉胸腔,并用負壓吸引吸出胸腔內血液和氣體。假手術組僅置縫線而不結扎冠脈。術后肌注青霉素。術后第4周末對假手術組大鼠與心衰組大鼠進行實驗。4肝素鈉鹽水凝膠的檢測使用烏拉坦麻醉各手術大鼠,行頸部切口并分離右頸總動脈,結扎遠心端,用動脈夾夾住近心端,在管壁上剪一很小的斜口,插入內徑0.5mm、外徑1mm并充滿1×105U/L肝素鈉生理鹽水的聚乙烯導管,經(jīng)右側頸總動脈向心端緩慢插入左心室,導管另一端通過壓力換能器連接到生理記錄儀,同步采集心率(heartrate,HR)、左心室收縮壓(leftventricularsystolicpressuer,LVSP)、左心室舒張末期壓(leftventricularend-diastolicpressure,LVEDP)和左心室內壓最大上升或下降速率(±dp/dtmax)。LVEDP≥15mmHg為心衰模型成功的標志。5神經(jīng)組織學檢測血流動力學檢測后對符合實驗標準的各手術大鼠行頸部切口并分離氣管,行氣管切開,股靜脈置管,術中使用肌松劑馳肌碘(gallamin)以25mg·kg-1·h-1持續(xù)泵入。行頸部切口并分離右頸總動脈,導管接壓力換能器,與橋式放大器相連,POWERLAB8/30同步采集測動脈血壓、平均動脈壓和心率(HR);后將動物俯位固定于大鼠腦立體定位儀上,再將大鼠取側俯臥位,經(jīng)腹膜后暴露左腎,在手術顯微鏡下剝離腎交感神經(jīng),將神經(jīng)置于雙極鉑絲電極上,灌入配制好的溫熱液體石蠟(37℃),使神經(jīng)與記錄電極結合處于周圍組織絕緣并濕潤和保護神經(jīng)。POWERLAB8/30系統(tǒng)采集信號,記錄腎交感神經(jīng)活動(renalsympatheticnerveactivity,RSNA)。6后槲至同一水平大鼠固定在腦立體定位儀上,沿矢狀縫做皮膚切口暴露顱骨,調整前囟和后囟至同一水平。PVN定位:B=1.8mm,L=0.4mm,H=7.9mm。B表示為前囟向后,L表示正中線左右旁開,H表示硬腦膜下深度。電鉆顱骨鉆孔,再用微量注射器插入PVN內。7腎兩種放電的噪聲實驗結束時,10%KCl靜脈注入處死動物,以此時神經(jīng)放電積分值作為腎交感神經(jīng)放電活動的噪聲水平。室旁核內微量注射2%滂胺天藍溶液(50nL)。剪取頭顱,去除顱骨,將腦組織固定于10%甲醛溶液中,2d后作切片,在顯微鏡下定位微量注射點位置,定位不準確者不列入統(tǒng)計。8rsnd反應數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,兩組間數(shù)據(jù)分析使用t檢驗,多組間數(shù)據(jù)比較使用q檢驗。統(tǒng)計學分析中,腎交感神經(jīng)放電(renalsympatheticnervedischarge,RSND)對藥物的反應以注藥前后實測值之差與注藥前相比的百分率表示,其中,微量注射前取1min內RSND的平均值,微量注射后,在達到最大反應后的1min時間內求RSNA反應的平均值。RSND值以實測值與噪聲值之差表示,噪聲值為股靜脈注射10%KCl后10min的RSNA值。所有實驗數(shù)據(jù)通過SPSS軟件17.0進行分析。結果1大鼠肝功能的評估1.1流量動力學的測量術后4周檢測大鼠血流動力學,手術組大鼠LVEDP較假手術組明顯增高(P<0.05),LVSP高于假手術組,但無顯著差異,見表1。1.2各組大鼠肺/體重值的比較取實驗后大鼠心臟,實驗結束后立即剪開胸壁暴露心臟與肺臟,隨即剪取心臟與肺臟,將心臟在濾紙上瀝干,稱重。同時稱取肺濕重。將心臟重與總體重相除,得到心臟/體重值,將肺濕重與總體重相除,得到肺/體重值。假手術組及心衰組大鼠的指標均來自于手術后4周獲得的組織標本。心衰組大鼠的心臟/體重指數(shù)高于假手術組,差異顯著(P<0.01),說明心梗后慢性心衰而引起的心臟肥大;心衰組大鼠的肺/體重指數(shù)高于假手術組(P<0.01),提示有心力衰竭引起的肺水腫,見表2。1.3心肌梗死誘導普通性心梗面積占左室面積的比例觀察心臟病理組織學變化,并采用Image-ProPlus6.0軟件面積法測定該心臟心梗面積占左室面積的比值,該比值≥30%為冠脈結扎術誘導心衰模型成功標志。見表2。2腎市場導向,腎神經(jīng)放電總參數(shù)表3中可以看出,HFAT1組大鼠與shamAT1組比較,前者腎交感神經(jīng)放電活動明顯減弱(P<0.05),HFAT2組與shamAT2組比較,腎交感神經(jīng)放電無顯著變化,各組大鼠注射藥物前后HR和MAP均有改變,但無明顯差異。圖1顯示,腎交感神經(jīng)的放電活動在AT1受體阻滯劑L-158809注射后,手術組和假手術組大鼠都有減弱趨勢,手術組減弱較假手術組減弱更為明顯,見圖1A、B。腎交感神經(jīng)的放電活動在AT2受體阻滯劑PD123319注射前后手術組與假手術組改變不明顯,見圖1C、D。心功能損害機制本研究使用SD大鼠冠狀動脈左前降支結扎導致心梗從而誘導慢性心衰動物模型,4周后可見,心衰組心臟/體重比與肺/體重比指數(shù)均高于假手術組,且有統(tǒng)計學意義;心衰組大鼠LVEDP較假手術組明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義;心臟病理組織學變化顯示梗死面積>30%(梗死面積為49.5±8.5),有統(tǒng)計學意義,表明心衰模型制作成功。據(jù)相關文獻報道,心力衰竭時循環(huán)內分泌激活,可加速心力衰竭的惡化,慢性心衰大鼠腎交感神經(jīng)活性明顯高于假手術組,這與我們的研究結果相一致。從我們的結果中可見,手術組RSNA在注射AT1受體阻滯劑L-158809后比注射前明顯減弱,而假手術組減弱不明顯;手術組注射AT2受體阻滯劑PD123319前后改變不明顯,而假手術組亦無相關改變。PVN是自主性和內分泌性反應的重要整合中樞,在維持心血管活動的動態(tài)平衡中起著關鍵作用。心衰時PVN中AT1受體介導的血管緊張素反應對交感神經(jīng)功能的調節(jié)有重要的作用。心衰大鼠PVN內AT1受體上調,使用AngII可明顯引起腎交感放電的增強。本研究中,AT1受體阻滯劑影響了AngⅡ受體介導的交感信號的輸出,阻斷了相關興奮性信號的轉導,從而抑制了腎交感神經(jīng)的放電。最近,Gao等發(fā)現(xiàn),心衰大鼠中RVLM內AT1受體蛋白的表達明顯升高,而AT2受體蛋白表達明顯下降,AT1/AT2受體比例上升。