豬sim1基因外顯子8的snp及其基因型頻率

豬sim1基因外顯子8的snp及其基因型頻率

隨著生活水平的提高，豬肉的品質(zhì)引起了人們的注意，越來越多的豬的體型特性也受到了豬養(yǎng)殖戶的關(guān)注。背膘厚度是脂肪性狀之一,是胴體性狀的一個(gè)重要指標(biāo)。降低背膘厚度可以提高瘦肉率,以滿足人們的消費(fèi)需求,同時(shí)可以增加養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益。通過研究與脂肪性狀相關(guān)的基因利用基因型選擇來降低背膘厚度,是胴體性狀改良的有效途徑。SIM1(Single-minded1)基因是bHLH-PAS(basichelix-loop-helix+period,aryIhydrocarbonreceptor,Single-minded)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,研究表明該家族基因編碼產(chǎn)生堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄子,是決定神經(jīng)細(xì)胞分化的功能基因。人和鼠的研究結(jié)果表明,SIM1基因控制下丘腦內(nèi)幾種主要神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)最終階段的分化,從而影響下丘腦內(nèi)視前核和室旁核的發(fā)育和形成,推測SIM1基因突變可能導(dǎo)致人與鼠的采食量和體脂的增加。Zhao等(待發(fā)表)分離出豬的SIM1基因片段并將其定位在1號染色體上,同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因第8外顯子780bp處T/C突變。基于這個(gè)SNP的發(fā)現(xiàn),本研究選擇約克夏、杜洛克、皮特蘭、長白豬、嘉興黑豬和金華豬6個(gè)品種共169頭豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采用PCR-SSCP方法檢測該位點(diǎn)在這些豬種中的遺傳多樣性,分析該位點(diǎn)對背膘厚的影響,進(jìn)一步確定SIM1基因?qū)χ拘誀畹淖饔?為豬的脂肪性狀的分子遺傳改良提供依據(jù)。1材料和方法1.1種豬群的測定杜洛克(10頭)、約克夏(34頭)、長白(18頭)的耳樣取自浙江省種豬質(zhì)量監(jiān)控中心測定豬,金華豬(20頭)、長白豬(20頭)的耳樣取自浙江省種質(zhì)資源調(diào)查群體,皮特蘭(31頭)樣品取自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?嘉興黑豬(36頭)樣品取自嘉興市嘉興黑豬種豬場。其中浙江省種豬質(zhì)量監(jiān)控中心豬群進(jìn)行活體10~11肋背膘厚、平均背膘厚(肩胛后沿、最后一根肋骨處及腰薦結(jié)合處三點(diǎn)平均背膘厚)和終測體重的測定,平均終測體重為98kg;浙江省種質(zhì)資源調(diào)查群體豬測定四點(diǎn)背膘厚(肩部最厚處、6~7肋間、最后一根肋骨處、腰薦結(jié)合處),平均屠宰重96.7kg。采用苯酚-氯仿抽提法提取基因組DNA,TE溶解,-20℃保存。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1特征引物序列參照NCBIGenBank登錄號NC_000076,采用Oligo6軟件設(shè)計(jì)特異引物(Forward5′-ATTGA-TTTGGGCCGGTTCAG-3′;Reverse5′-TGAGGAC-NTAGTTGACGCTG-3′)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,用無離子水溶解后,-20℃保存待用。1.2.2pcr擴(kuò)增條件PCR擴(kuò)增體系:10×PCR緩沖液1.5μL;MgCl2(25mmol/L)1.2μL;dNTP(10mmol/Leach)0.375μL;上下游引物(100μmol/L)各0.45μL;模板DNA1μL;TaqDNA酶(2U/μL)0.5μL;加滅菌雙蒸水至總反應(yīng)體積15μL。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,58℃復(fù)性30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán);最后再72℃延伸5min,4℃保存,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。1.2.3%溴酚藍(lán)的制備變性反應(yīng)體系12μL,其中5μLPCR產(chǎn)物,7μL的loadingbuffer(98%甲酰氨、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)和2%甘油),98℃變性10min,然后立即冰浴5min以上。12%PAGE膠(29︰1)電泳18h,電泳結(jié)束后銀染顯帶,利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄。1.3glm過程估計(jì)基因頻率和基因型頻率的計(jì)算方法參見文獻(xiàn)方法。以終測體重為協(xié)方差,利用SAS9.0軟件GLM過程估計(jì)了基因型對脂肪性狀的效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)模型采用Yi=μ+g+αi+g*αi+ei,其中Yi為性狀測定值,μ為總體平均數(shù),g為種群效應(yīng)值,αi為基因型效應(yīng)值,g*αi為種群與基因型互作效應(yīng)值,ei為隨機(jī)誤差。2結(jié)果與分析2.1長度約200b瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度約200bp。進(jìn)行SSCP分析,發(fā)現(xiàn)3種基因型(圖1),測序結(jié)果顯示,3種基因型分別為CC、CT和TT型(圖2)。2.2ct基因型頻率6個(gè)豬品種在SIM1外顯子8的基因頻率和基因型頻率分布列于表1。由表1可以看出,國內(nèi)外豬種在此位點(diǎn)存在很大差異,國外豬種中,CT基因型平均頻率最高,為0.58,國內(nèi)豬種中只有TT基因型。在國外豬種中長白豬的CC基因型頻率(0.11)最高,皮特蘭的CT基因型頻率(0.80)最高,約克夏的TT基因型頻率(0.65)最高,而在國內(nèi)豬種嘉興黑豬和金華豬中只檢測到TT基因型。在國外豬種中等位基因C的頻率(0.50)在皮特蘭豬中最高,等位基因T的頻率(0.80)在約克夏豬中最高。2.3sim1基因?qū)ωi背骨厚度的影響2.3.1sim1基因型對長白豬腰薦結(jié)合處背瞳厚的影響采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件,對浙江省種質(zhì)資源調(diào)查群長白豬不同基因型對個(gè)體胴體性狀效應(yīng)進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)和多重比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn):SIM1基因型對長白豬腰薦結(jié)合處背膘厚的效應(yīng)顯著。SIM1基因CC型個(gè)體比CT型個(gè)體背膘厚增厚顯著(P<0.05),CC型個(gè)體比CT型個(gè)體的背膘厚增加48.9%,但是TT型個(gè)體與CC型個(gè)體以及CT型個(gè)體之間的背膘厚差異不顯著。在肩部背膘、6~7肋骨背膘和最后一根肋骨背膘,各基因型個(gè)體間差異均不顯著(表2)。2.3.2cc型與ct型背材料的背階段效應(yīng)通過SAS軟件分析了SIM1不同基因型對浙江省種豬質(zhì)量監(jiān)控中心國外種豬10~11肋背膘厚和平均背膘厚的效應(yīng)(表3)。由表3可以看出,不同SIM1基因型對10~11肋背膘厚效應(yīng)顯著,對平均背膘厚效應(yīng)極顯著。在10~11肋處,CC型個(gè)體和TT型個(gè)體的背膘厚均顯著地高于CT型個(gè)體的背膘厚(P<0.05),CC型個(gè)體比CT型個(gè)體背膘厚增加23.1%,TT型個(gè)體比CT型個(gè)體背膘厚增加9.2%。對于平均背膘厚,CC型個(gè)體和TT型個(gè)體的背膘厚也均顯著地高于CT型個(gè)體的背膘厚(P<0.05),CC型個(gè)體比CT型個(gè)體平均背膘厚增加24%,TT型個(gè)體比CT型個(gè)體背膘厚增加10.8%。3討論3.1在室旁核和人和鼠的行為中發(fā)揮重要作用到目前為止,許多研究報(bào)道了下丘腦室旁核同能量平衡和食欲調(diào)節(jié)的關(guān)系,Choi等證明室旁核內(nèi)的選擇性損傷會(huì)導(dǎo)致大鼠攝食過度和肥胖;Kalra等發(fā)現(xiàn)室旁核內(nèi)顯微注射多種促食欲信號蛋白可以增加小鼠食欲,而注射抑制食欲蛋白則會(huì)降低小鼠食欲;Cowley等發(fā)現(xiàn)室旁核內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞可以尋找并結(jié)合具有食欲調(diào)節(jié)作用的軸突分泌物,例如MSH信號蛋白;并且發(fā)現(xiàn)多個(gè)調(diào)控能量平衡的關(guān)鍵因子都在下丘腦表達(dá)。由此可見,下丘腦室旁核在食欲調(diào)節(jié)和能量平衡中起到關(guān)鍵作用。Holder等發(fā)現(xiàn)SIM1基因主要表達(dá)在野生成年鼠下丘腦的室旁核和視前核,Michaud等證明SIM1純合缺失(SIM1-/-)小鼠室旁核沒有發(fā)育,出生前死亡,而SIM1雜合缺失(SIM1-/+)小鼠能夠成活,但SIM1-/+鼠的室旁核內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量只有同窩正常小鼠的76%,并且表現(xiàn)早發(fā)性肥胖、生長迅速,伴有高胰島素血癥。人和鼠SIM1基因第8外顯子也存在一個(gè)T/C突變,但其位置不同(GenBank登錄號分別為NC_000006和NC_000076)。SIM1基因被平衡易位斷開的患者臨床表現(xiàn)PWS(Prader-Willisyndrome)癥狀、早發(fā)性肥胖、食欲旺盛。室旁核內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)MC4R(Melanocortin-4Receptor),MC4R作為α-促黑素激素的靶細(xì)胞,在人和鼠的體重、能量穩(wěn)態(tài)和采食量的調(diào)控中具有重要作用。由此可以推斷,SIM1基因在人和鼠的能量平衡、脂肪代謝過程中起重要作用。DeKoning等在SIM1基因所在區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)影響生長率的QTL,Nezer等利用基因組掃描檢測皮特蘭×大白豬雜交家系,在這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)影響背膘厚和日采食量的QTL,Beeckmann等報(bào)道了在這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)影響頭的重量和采食量的QTL。因此可以推測,SIM1是豬胴體性狀合適的候選基因。3.2等位基因c的分布本實(shí)驗(yàn)中,長白、約克夏、杜洛克豬群的SIM1基因純合子個(gè)體背膘厚大于雜合子個(gè)體背膘厚,CC型個(gè)體和TT型個(gè)體背膘厚與CT型個(gè)體背膘厚差異達(dá)到顯著。由此可推測該位點(diǎn)純合子有脂肪沉積效應(yīng),而雜合子效應(yīng)不明顯。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)嘉興黑豬和金華豬在該位點(diǎn)不存在變異,均表現(xiàn)為TT型,外國豬種CT型個(gè)體較多,皮特蘭CT型個(gè)體達(dá)到80%,且不同品種等位基因C的分布頻率也不同,這可能是皮特蘭豬具有高瘦肉率的一個(gè)原因。本研究中,國內(nèi)豬種只檢測到TT基因型,因而無法分析在國內(nèi)豬種不同基因型是否也存在類似國外豬種的情況。此外,國內(nèi)豬種的背膘厚都高于國外豬種的背膘厚,可能在討論SIM1基因特定基因型對背膘厚的影響時(shí),要考慮遺傳背景的影響。我們知道國內(nèi)地方豬種具有生長速度慢、肉質(zhì)優(yōu)良而脂肪含量高的特點(diǎn),而國外豬種具有生長速度快,脂肪