Ulk1避免乙醇誘發(fā)的神經(jīng)元應激和認知相關的行為缺陷

Ulk1避免乙醇誘發(fā)的神經(jīng)元應激和認知相關的行為缺陷Ulk1protectsagainstethanol-inducedneuronalstressandcognition-relatedbehavioraldeficits引言酒精中毒是神經(jīng)元適應性對慢性乙醇攝入導致的神經(jīng)應激做出反應而發(fā)展的一種精神疾病。神經(jīng)元可以通過激活細胞保護機制（包括自噬）來適應乙醇誘導的代謝變化。Ulk1（一種對自噬調節(jié)至關重要的基因）的表達在慢性間歇性乙醇（CIE）暴露后的小鼠前額葉皮質（PFC）中受到影響。本研究基于最近的微陣列研究的發(fā)現(xiàn)，顯示CIE暴露后小鼠PFC中Ulk1mRNA表達的短暫性和主要改變。本研究的目標有三個：第一個目標是確定CIE后Ulk1mRNA表達的時間依賴性變化。第二個目標是評估CIE對Ulk1活性以及PFC中的神經(jīng)元自噬的整體影響。第三是研究與PFC功能相關的Ulk1活動和CIE暴露的后果。乙醇管理對于定量PCR（qPCR），蛋白質印跡和免疫組織化學的慢性間歇乙醇（CIE）暴露，給予4個周期的CIE（20％乙醇4天，然后用水7天），然后腹膜內注射乙醇（2g/kg體重，每日一次，15％溶液）4天，最終注射24小時后收集組織（用于Western印跡，免疫組織化學）。為了評估CIE對多個CIE周期的自愿乙醇飲酒的影響，對CIE方案進行了修改，在每個循環(huán)后，向每只小鼠提供20%乙醇和水4天，通過飲水測量裝置測量消耗量。（兩瓶選擇）每天測量每24小時消耗的乙醇和水的體積，并通過體重（ml/g）標準化。定量聚合酶鏈反應（qPCR）最終注射乙醇后，將小鼠斷頭，將頭蓋和毛皮覆蓋的整個腦淹沒在液氮中6秒急冷，迅速將腦中額葉切除，并在4℃下保存在RNA后期溶液（ThermoFisher）中。用RNeasyMini試劑盒（Qiagen）從PFC中提取總RNA用ReverTraAcecDNA5合成試劑盒（Toyobo）逆轉錄所有數(shù)據(jù)用Gapdh標準化作為參考蛋白質印跡將額葉在冰冷的TNE緩沖液（20mMTris-HCl[pH=8]，150mMNaCl，1mMEDTA）中溶解，補充1％TritonX-100，蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物，并通過10個短脈沖（每次1秒）以5秒間隔在脈沖之間進行超聲處理。將組織裂解物在4℃下離心（20,000×g）10分鐘，并將上清液中提取的蛋白質進行SDS，然后進行Western印跡分析。使用的一抗：抗-P62（豚鼠，1:1000，MBL），抗-Ulk1（兔，1：1,000，CellSignalingTechnology[CST]），抗磷酸-Ulk1（Ser-555）（兔，1：1,000，CST）和抗-微管蛋白（小鼠單克隆[B-5-1-2]，1：8,000，Sigma）。免疫組化用PBS中的4％多聚甲醛（PFA）經(jīng)血管灌注小鼠，將全腦從頭骨中解剖出來。然后將灌注的腦在4℃的4％PFA中在4℃下固定過夜，然后在4℃的PBS中保存。使用vibratome（振動切片機）制備序列50μm的冠狀切片。將切片在PBS，10％山羊血清，室溫下孵育30分鐘，然后在4℃下進行一次抗體16小時，并在室溫下通過二級抗體孵育1小時。使用的一抗：抗p62（豚鼠，1：400，MBL）和抗CaMKIIα（小鼠單克隆[6G9]，1：1,000，Stressmarq）。使用共焦顯微鏡觀察染色樣品。行為測試開放現(xiàn)場測試小鼠（2?3個月大）用4個周期的CIE治療，隨后4天腹膜內注射乙醇，最后注射24小時后，在開放場箱（W×D×H=40×40×27cm）中測量其運動活性。將每只小鼠放置在盒子的中心，使用EthoVision軟件（Noldus）對中心區(qū)域（W×D=20×20cm）花費的總距離（cm）和時間（秒）進行刻痕。新型對象識別測試在開放場箱中連續(xù)3天馴化5分鐘后，小鼠在15分鐘后呈現(xiàn)兩個相同的對象（A，A），其次是一個物體（A）和一個新物體（B）另外一個新物體（C）加上物體（B）24小時后。在每個時間點對每個對象的交互時間進行評分，并對對象