專題一 1.2 基因工程的基本操作程序

1．2基因工程的基本操作程序

目的基因的獲取1．目的基因的概念：主要指編碼____________的基因。蛋白質(zhì)2．目的基因的獲取途徑：(1)從基因文庫獲取。

①基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入__________的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。②部分基因文庫：只包含一種生物的一部分基因，如cDNA文庫。(2)利用________技術(shù)擴(kuò)增。(3)通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。受體菌PCR基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1．目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可在下一代的細(xì)胞中________和發(fā)揮作用。2．基因表達(dá)載體的組成：目的基因、__________、終止子、標(biāo)記基因等。表達(dá)啟動子將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1．轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和________的過程。 2．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：(1)常用方法：________________法。(2)其他方法：基因槍法、花粉管通道法等。3．將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞：常用的技術(shù)是顯微注射技術(shù)。4．將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：表達(dá)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化目的基因的檢測與鑒定1．目的基因的檢測：利用DNA分子雜交技術(shù)檢測目的基因的有無。2．目的基因表達(dá)檢測：(1)利用分子雜交技術(shù)檢測目的基因的______________。(2)利用________________檢測目的基因的翻譯。3．個體生物學(xué)水平鑒定：抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)錄抗原－抗體雜交

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1．PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：(1)PCR：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。(2)目的：獲取大量的目的基因。(3)原理：雙鏈DNA復(fù)制的原理。(4)需要條件：模板DNA、引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)、緩沖溶液。

(5)方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后引物與單鏈相應(yīng)的互補(bǔ)序列結(jié)合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。 (6)特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))。 (7)過程：變性→復(fù)性→延伸(重復(fù))。PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理DNA雙鏈復(fù)制(堿基互補(bǔ)配對)原料四種游離的脫氧核苷酸條件模板、酶等不同點(diǎn)解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化場所體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)

細(xì)胞內(nèi)含有的DNA聚合酶結(jié)果

在短時間內(nèi)形成大量的DNA片段形成整個DNA分子2．DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較：基因工程的核心——基因表達(dá)載體的構(gòu)建1．表達(dá)載體的組成：目的基因＋啟動子＋終止子＋標(biāo)記基因。下圖是表達(dá)載體的模式圖：(1)啟動子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位。(2)終止子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。它使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。

(3)標(biāo)記基因：一種已知功能或已知序列的基因，起著特殊標(biāo)記的作用，用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因(目的基因是否導(dǎo)入成功)。如抗生素基因或熒光基因等。2．構(gòu)建方法：(1)切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶必須是同一種酶，以獲得相同的黏性末端，利于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。

(2)將切下的目的基因片段，插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，使質(zhì)粒與目的基因結(jié)合成重組質(zhì)粒。受體種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti 質(zhì)粒的T—DNA 上→農(nóng)桿菌→導(dǎo) 入植物細(xì)胞→整 合到受體細(xì)胞的 DNA→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取 卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀 的動物

Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì) 胞吸收DNA分子比較不同受體種類的目的基因的導(dǎo)入方法真核生物的基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞后，不能正常發(fā)揮功效的可能原因有：(1)被細(xì)菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶破壞。(2)該基因指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)不能在細(xì)菌體內(nèi)正確修飾和表達(dá)。(3)細(xì)菌的RNA聚合酶不能識別真核基因的位點(diǎn)，致使不能啟動轉(zhuǎn)錄。類型步驟檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測

第一步(導(dǎo)入檢測)

轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目 的基因DNA分子雜交(DNA和DNA之間)是否成功顯示出雜交帶

第二步(轉(zhuǎn)錄檢測)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)(DNA 和mRNA之間)同上

第三步(翻譯檢測)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交同上個體水平鑒定/①確定是否具有抗性及 抗性程度②基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性是否相同①抗蟲或抗病的接種 實(shí)驗(yàn)②基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品活性的比較是否賦予了預(yù)期抗性或蛋白質(zhì)活性目的基因的檢測與鑒定技術(shù)的對比注：基因工程成功的標(biāo)志是目的基因的表達(dá)，即目的基因能翻譯成所需的蛋白質(zhì)。

目的基因的獲取【例1】在已知某小片段基因堿基序列的情況下，獲得該基因的最佳方法是()A．用mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成DNAB．以4種脫氧核苷酸為原料人工合成C．將供體DNA片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，再進(jìn)一步篩選D．由蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測mRNA

【名師點(diǎn)撥】現(xiàn)在已知的條件只是某小片段基因的堿基序列，而沒有相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所以只能以4種脫氧核苷酸為原料來人工合成?！敬鸢浮緽【配對練習(xí)1】以下關(guān)于PCR技術(shù)的說法中，不正確的是()

A．生物體內(nèi)DNA的復(fù)制也稱為PCR B．該技術(shù)操作過程中要遵循堿基互補(bǔ)配對原則 C．PCR