高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)保健食品中23種違禁精神藥品

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)保健食品中23種違禁精神藥品

慢性失眠一直是所有國(guó)家人民常見(jiàn)的疾病。精神藥品包括苯二氮類、巴比妥類、非苯二氮類抗焦慮劑,常用于治療失眠、焦慮等臨床疾病;但這類藥物副作用大,且治標(biāo)不治本,需長(zhǎng)期服用,易產(chǎn)生依賴性。某些生產(chǎn)廠家利用保健品成分復(fù)雜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善等監(jiān)管空缺,在保健品中非法添加精神藥品以提高其產(chǎn)品的療效,欺騙消費(fèi)者。建立保健品中非法添加精神藥品的快速檢測(cè)方法對(duì)防止和打擊此類不法行為,保障人民健康具有極為重要的意義。精神藥品的濫用一直是全球關(guān)注的重點(diǎn)之一。各類基質(zhì)中多種微量精神藥品的檢測(cè)均有報(bào)道,包括血液、尿液、頭發(fā)和指甲、唾液、奶制品、動(dòng)物組織、中成藥及保健品等。檢測(cè)方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、HPLC法、GC法、GC-MS法、HPLC-MS/MS法和UPLC-Q-TOF-MS法等。保健食品中通常含有多種中藥材,基質(zhì)復(fù)雜多樣,薄層掃描法、ELISA和HPLC法在定性時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,已經(jīng)不適用于保健食品中精神藥品分析的要求。GC和GC-MS對(duì)部分藥物的分析需要進(jìn)行衍生化,費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。HPLC-MS/MS法靈敏度高,選擇性和特異性好,在多組分微量成分的分析上顯示出了極大的優(yōu)越性,被越來(lái)越多地用于保健食品中非法添加化學(xué)藥物的研究。目前已報(bào)道的檢測(cè)方法多為同時(shí)檢測(cè)幾種或十余種精神藥品,而且多為早期臨床上使用的鎮(zhèn)靜安神類藥物。隨著醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展,更多的化學(xué)藥物用于失眠癥的治療。生產(chǎn)企業(yè)也會(huì)選擇尚未被監(jiān)測(cè)的活性成分添加。建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高、定性和定量準(zhǔn)確、能同時(shí)檢測(cè)數(shù)十種精神藥品的分析方法勢(shì)在必行。本研究收集了臨床上具有鎮(zhèn)定安神效果的23種化學(xué)藥物,建立了可以對(duì)其同時(shí)檢測(cè)和確證的HPLC-MS/MS法,為保健食品中違禁精神藥品的監(jiān)督提供了有力的工具。1實(shí)驗(yàn)部分1.1對(duì)照品甲醇溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液ACCELA高效液相色譜儀、TSQQuantumAccessMax三重四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源,美國(guó)ThermoFisher公司生產(chǎn));D-78224超聲波清洗機(jī)(德國(guó)Elma公司生產(chǎn));Sigma1-14離心機(jī)(德國(guó)賽多利斯公司);甲醇、乙腈和甲酸銨均為色譜純(迪馬公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司)制備。標(biāo)示具有改善睡眠功能的保健食品樣品購(gòu)自本地超市及本實(shí)驗(yàn)室檢品。23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)品:阿普唑侖(alprazolam)、異戊巴比妥(amobarbital)、氯硝安定(clonazepam)、氯氮卓(chlordiazepoxide)、安定(diazepam)、艾司唑侖(estazolam)、勞拉西泮(lozazepam)、安寧(meprobamate)、安眠酮(methaqualone)、咪唑安定(midazolam)、硝基安定(nitrazepam)、去甲安定(nordiazepam)、奧沙西泮(oxazepan)、苯巴比妥(phenobarbital)、三唑侖(trizolam)、扎來(lái)普隆(zaleplon)(1mg/mL甲醇溶液,美國(guó)Cerilliant公司);阿扎哌隆(azaperone)和氯丙嗪(chlorpromazine)(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer實(shí)驗(yàn)室);巴比妥(barbital)和氯氮平(clozapine)(中國(guó)食品藥品檢定研究院);氟哌啶醇(haloperidol)、奮乃靜(perphenazine)和賽拉嗪(xylazine)(Sigma公司)。標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取一定量的固體標(biāo)準(zhǔn)品,以甲醇為溶劑,分別制備質(zhì)量濃度為1g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。購(gòu)于Cerilliant公司的上述對(duì)照品甲醇溶液亦作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于-20℃冰箱中保存。分別精密量取上述23種對(duì)照品溶液適量,置于10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,得含巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥均為100mg/L,含安眠酮、氟哌啶醇、阿扎哌隆、咪唑安定、氯氮平和奮乃靜均為2mg/L,含其他14種對(duì)照品均為10mg/L的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。1.2樣品的提取取供試品(片劑,取數(shù)片,研細(xì);膠囊劑,取數(shù)粒,傾取內(nèi)容物,研細(xì)),準(zhǔn)確稱取1.0g樣品于10mL容量瓶中,加甲醇適量,超聲提取20min,放冷,加甲醇至刻度,搖勻。于12000r/min離心5min,上清液用于HPLC-MS/MS測(cè)定。1.3洗脫程序及質(zhì)譜條件色譜條件:色譜柱為AgilentEclipsePlusC18柱(100mm×2.1mm,3.5μm)。流動(dòng)相A為10mmol/L甲酸銨溶液,流動(dòng)相B為乙腈-甲醇(1∶1,v/v)溶液。梯度洗脫程序:0~2min,12%B;2~6min,12%B~50%B;6~12min,50%B;12~17min,50%B~100%B;17~18min,100%B~12%B;18~23min,12%B。流速0.3mL/min,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μL。質(zhì)譜條件:電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)切換;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);噴霧電壓:+3.0kV或-2.5kV;輔助氣(N2)流量:3.0L/min;鞘氣(N2)流量:12L/min;碰撞氣(Ar)壓力:0.200Pa(1.5mTor);毛細(xì)管溫度:350℃;氣化溫度:400℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。2結(jié)果與討論2.1試驗(yàn)條件的研究2.1.1流動(dòng)相的優(yōu)化首先利用流動(dòng)注射的方式對(duì)各種待測(cè)化合物的管透鏡電壓和碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化,得到的各物質(zhì)的特征離子和碰撞能量如表1所示。23種化合物的母離子均為準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+或[M-H]-;2種電離方式可以同時(shí)檢測(cè)。為了獲得良好的分離效果和離子化效率,本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。分別比較了甲醇和乙腈作為有機(jī)相,水、乙酸銨和甲酸銨作為水相的分離效果。結(jié)果將甲醇和乙腈按1∶1的體積比混合作為有機(jī)相的分離效果最好;水相中加入緩沖鹽,多個(gè)化合物的拖尾峰形得到明顯的改善,響應(yīng)值增大;甲酸銨與乙酸銨相比,能使保留時(shí)間短的化合物出峰時(shí)間延長(zhǎng),減少了基質(zhì)的干擾。最終將流動(dòng)相確定為甲醇-乙腈(1∶1,v/v)為有機(jī)相,10mmol/L甲酸銨溶液作水相,梯度洗脫分離。優(yōu)化條件下23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖見(jiàn)圖1。2.1.2液作提取溶劑本實(shí)驗(yàn)中23種目標(biāo)化合物于甲醇中均有較好的溶解度,故選擇不同濃度的甲醇水溶液作提取溶劑,比較其提取效果。試驗(yàn)結(jié)果表明,甲醇濃度越低,提取液的顏色越深,水溶性雜質(zhì)越多。對(duì)于大多數(shù)保健品,以100%甲醇提取時(shí),高速離心后的提取液比較潔凈,無(wú)需進(jìn)一步凈化,簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程,最終確定以甲醇為提取液。2.2方法研究2.2.1線性范圍和檢出限為了比較樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物質(zhì)譜響應(yīng)的影響,以陰性口服液和陰性膠囊樣品制作空白基質(zhì)溶液,分別添加相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品制備空白基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別以各分析物的峰面積(Y)和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X,μg/L)進(jìn)行線性回歸計(jì)算,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。巴比妥、異戊巴比妥、苯巴比妥的線性范圍為0.1~10μg/L,安眠酮、咪唑安定、氯硝安定、阿扎哌隆、氟哌啶醇、奮乃靜的線性范圍為0.002~0.2μg/L,其他14種化合物的線性范圍為0.01~1μg/L。在線性范圍內(nèi),各分析物均有良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2均不小于0.990)?？诜汉湍z囊樣品基質(zhì)使得某些目標(biāo)化合物質(zhì)譜信號(hào)增加或減少,如賽拉嗪、安眠酮、硝基安定、扎來(lái)普隆、氯硝安定、氯氮平、阿扎哌隆等,但其斜率變化均在標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的±20%范圍內(nèi),因而可忽略基質(zhì)效應(yīng)。2.2.2檢測(cè)限和檢出限取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇倍比稀釋后測(cè)定,以信噪比約為3時(shí)對(duì)應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為檢出限;以信噪比約為10時(shí)對(duì)應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為定量限。各目標(biāo)藥物的檢出限和定量限結(jié)果見(jiàn)表2。2.2.3加標(biāo)回收和測(cè)定化合物的準(zhǔn)確度以不含目標(biāo)化合物的口服液和膠囊保健品為本底,分別在3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定。巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥的3個(gè)加標(biāo)水平分別為0.1、1和10mg/L;安眠酮、氟哌啶醇、阿扎哌隆、咪唑安定、氯氮平和奮乃靜6種化合物分別為0.002、0.02和0.2mg/L;其他14種化合物分別為0.01、0.1和1mg/L;平行測(cè)定6次,以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度。所得到的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表2。所得結(jié)果均符合食品理化檢測(cè)要求。2.3種飲品添加的種類分別按1.2節(jié)的方法處理13種樣品,依法測(cè)定。結(jié)果表明,13種保健品中有一種添加了安寧(20