人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶及其抑制劑研究報(bào)告

---....word.zl人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶及其抑制劑爭(zhēng)論人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(humanneutrophil人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(humanneutrophilelastase，HNE重構(gòu)〔如肺炎〕、成人呼吸窘迫綜合征、肺纖維化、急〔慢〕性肺損傷、肺水腫、動(dòng)脈粥樣化。目前，國外用HNE抑制劑來治療這一類炎癥疾病的爭(zhēng)論格外廣泛，并已成功開發(fā)出第一個(gè)以抑制HNEsivelestatsodiumhydrate〕，從而促進(jìn)了HNE抑制劑的爭(zhēng)論與開發(fā)。BM的生理、病理作用及構(gòu)造特征HNE，又稱人白細(xì)胞彈性蛋白酶〔humanleukocyteelastase，IRE〕，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶類〔matrixmetalloproteinases,MMPs〕，即MMP-12,是一種金屬離子依靠性基質(zhì)降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+離子的存在才具有酶活性，其底物類型格外廣泛，幾乎可降解細(xì)胞外基質(zhì)約每106個(gè)細(xì)胞中含有HNE的總量為3μgHNEHNE過量表達(dá)那么會(huì)對(duì)機(jī)體組織、基質(zhì)造成危害，表現(xiàn)為破壞血管壁組分出血管并向炎癥部位趨化集中及釋放IL-8、TNF-α等炎癥因子；它還能降解細(xì)胞基質(zhì)，催化caspase3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，HNE還能增加病毒、細(xì)菌及癌細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的黏附力氣，促進(jìn)微生物的入侵及癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。HNE存在于中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是由218個(gè)氨基酸組成的單一肽鏈，分子質(zhì)量大約25.9kD，含4個(gè)二硫鍵，是絲氨酸蛋白酶家族一員，因此與其他絲氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最適pH值接近中性。HNE的基因位于19號(hào)染色體的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒細(xì)胞中并無HNE的mRNA表達(dá)，說明此種酶只在未成熟的骨髓細(xì)胞中合成。酶的催化中心由His41、Asp88和Ser173三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，Ser殘基側(cè)鏈上羥基具有很高的親核性，簡(jiǎn)潔結(jié)合不帶電的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、MetBM抑制劑HNE對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生各種病理作用，故關(guān)于其抑制劑的爭(zhēng)論也受到廣泛關(guān)注，其中包括源性抑制劑、合成的外源性抑制劑〔蛋白類、擬肽和雜環(huán)化合物〕以及自然提取物等。源性抑制劑人體存在很多種針對(duì)HNEHNE抑制劑Elafin7kD，是酸穩(wěn)定性多膚；α-抗蛋白酶〔α-antiprotease〕在血漿中具高濃度，并由此進(jìn)入組織發(fā)揮作1 1用。上述源性抑制劑包括α-巨球蛋白均為分泌性彈性蛋白酶抑制劑，其中α-抗蛋白酶被2 1認(rèn)為是在體各種臟器中起主導(dǎo)作用的源性HNE抑制劑。α-抗蛋白酶 它在很多生理、病理過程中〔如血液分散、纖維蛋白溶解、炎癥等〕1起調(diào)整蛋白分解的作用，并且對(duì)防止蛋白水解性組織損傷起重要作用。據(jù)報(bào)道先天性α-抗1蛋白酶缺損極易引發(fā)肺氣腫和自發(fā)性肺纖維化〔idiopathicpulmonaryfibrosis〕。α-抗蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，存在于血漿中，平均分子質(zhì)量約50k1D，含有3個(gè)β片層構(gòu)造和假設(shè)干αMet358打算了它對(duì)HNE的抑制特異性，HNE與之結(jié)合后形成穩(wěn)定酯構(gòu)造，致使酶的活性中心構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，不能去酞基化，這種抑制機(jī)制被稱為性底物抑制。對(duì)α-抗蛋白酶的構(gòu)造爭(zhēng)論顯示，它和其他HNE拮抗劑一1樣，在酶結(jié)合位點(diǎn)或四周的Met上的硫醚鍵對(duì)化學(xué)氧化格外敏感，一旦Met被亞砜化后，α1-抗蛋白酶即失活。在體氧化自由基的增多是造成這種源性抑制劑失活的主要緣由氧化物酶通過過氧化酶-過氧化氫-鹵化物系統(tǒng)使α_抗蛋白酶氧化失活，從而到達(dá)HNE活1性增高，促進(jìn)細(xì)胞滲透轉(zhuǎn)移的目的。在體外試驗(yàn)中，中性粒細(xì)胞中的過氧化物系統(tǒng)可使α-1抗蛋白酶在10秒之失活50%，20秒之完全失活。Elafin 它是一種被爭(zhēng)論得比較深入的源性抑制劑，又稱為彈力素，屬于Trappin-2基因家族。它在多種上皮組織中表達(dá)，如毛囊、食管、陰道和口腔中等。在人皮膚正常組織中沒有表達(dá)，但在皮膚受外傷和牛皮癬等炎癥反響時(shí)那么會(huì)猛烈地表達(dá)。翻譯后的elafin蛋白質(zhì)前體是由117個(gè)氨基酸組成的多膚鏈〔12.3kD〕，包括由22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)膚，其活性部位在C端，以49.9kD的成熟蛋白，即elafin。爭(zhēng)論說明，在HNE誘導(dǎo)的急性肺損傷倉鼠模型中，于誘導(dǎo)前1小時(shí)經(jīng)氣管賜予elafin，其抑制HNE的IC 為8.1μg/kg。50目前對(duì)elafin的爭(zhēng)論著眼于其在動(dòng)脈粥樣硬化、心臟移植后冠狀動(dòng)脈疾病、心肌壞死以及的主要并發(fā)癥，發(fā)病原理與冠狀動(dòng)脈血管壁增厚有關(guān)，而由HNE活性上升引起的彈性蛋白降解沉積、IL-1程中起關(guān)鍵作用。在家兔心臟移植模型中，賜予重組人elafin可以有效的降低HNE活性，形態(tài)學(xué)、免疫組化和生化分析說明，與比照組相比，elafin給藥組家兔的血管壁增厚程度降低70%。將elafin細(xì)胞外彈性蛋白量；雖然elafin會(huì)導(dǎo)致血管膜形成減緩，總體上仍具有防止血管粥樣硬化惡化的效果。外源性抑制劑對(duì)合成類HNE抑制劑的爭(zhēng)論已有約20年歷史，其間涌現(xiàn)出大批很有前景的小分子合成systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS〕的HNE特異性抑制劑上市。合成類HNE抑制劑又包括蛋白類、三肽或四肽和氮雜環(huán)類化合物等，此外，有報(bào)道稱β酰胺類抗生素和苯基丁氮酮類上市老藥對(duì)HNE也有抑制作用。制劑的爭(zhēng)論中，承受構(gòu)建的限制性構(gòu)造組合膚庫，篩選HNE的特異底物，這種方法篩選得HNE抑制劑在序列上具有很高的同源性，并且對(duì)其重組蛋白的分析說明它們均具有HNE抑制作用，抑制常數(shù)Ki65nmol/L。在對(duì)自然HNE抑制劑的爭(zhēng)論過程中覺察，每種抑制劑與HNE活性中心結(jié)合的作用位點(diǎn)〔P〕幾乎都在一個(gè)延長(zhǎng)出來的環(huán)上，而P1位點(diǎn)上的氨基酸殘基主要打算抑制劑的抑制特1異性。HNE簡(jiǎn)潔與P 位點(diǎn)上有小烷基側(cè)鏈的底物結(jié)合，尤其易與Val殘基結(jié)合。構(gòu)建的多1肽依據(jù)自然底物的構(gòu)造形式，形成環(huán)狀構(gòu)造，可將P1位點(diǎn)遞呈到酶的活性中心。在此構(gòu)造根底上，對(duì)P1和其他位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)展修飾，使之進(jìn)一步成為對(duì)HNE具有高度選擇性的化合物。據(jù)報(bào)道，限制性構(gòu)造組合肽庫同樣可以用來篩選α-胰糜蛋白酶、豬胰彈性蛋白選出的大局部抑制劑可以同時(shí)抑制這一類酶。西維來司鈉2023年11月，氮雜環(huán)類化合物西維來司鈉〔商品名Elaspol〕在日本上市，其化學(xué)名為N-[2-[4-(2，2-二甲基丙酸基〕苯磺酰氨基丁氨基乙酸鈉，分子質(zhì)量為528.51D，適應(yīng)證是全身性炎癥反響綜合征和急性肺損傷，且正在進(jìn)展用于呼吸窘迫綜合征治療的n吸器引起的壓力性損傷及呼吸道感染的并發(fā)率典型性肺炎臨床表現(xiàn)親熱相關(guān)的病癥，我國已于2023年5月批準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)展臨床試驗(yàn)，它是我國發(fā)生非典型性肺炎后首個(gè)通過“綠色通道〞加快批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物。以琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-N-對(duì)硝基苯胺為底物的酶抑制試驗(yàn)說明，西維來司鈉對(duì)HNE的IC 為(0.044±0.003)μmol/L,抑制常數(shù)K為(0.20±0.02)μmol/LHIVE的競(jìng)爭(zhēng)50 i性抑制劑，并且具有很高的專一性，即使在濃度為100μmol/L時(shí)，它對(duì)胰蛋白酶、凝血酶、纖溶酶、激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G等仍沒有抑制作用，對(duì)豬胰彈性蛋白酶僅有很微弱的抑制作用，其IC 是對(duì)HNE的IC 的130倍。而它對(duì)各種試驗(yàn)動(dòng)物，如小50 50鼠、倉鼠、大鼠、狗及家兔的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶都有抑制作用，且酶學(xué)反響測(cè)得的其IC 甚至比對(duì)HIVE的IC 更小。50 50及體外模型中均表現(xiàn)出良好的藥理作用。給伯萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型靜脈注射本品，可以削減成纖維細(xì)胞的生成，降低中性粒細(xì)胞在炎癥部位的聚攏數(shù)量以及炎癥因子如IL-1β、血小板源生長(zhǎng)因子〔PDGF〕、巨嗜細(xì)胞炎癥蛋白-2、胰島素樣生長(zhǎng)因子A等的mRNA并主要作用于發(fā)病急性期。腺炎等，其應(yīng)用前景寬闊。HNE的體外表達(dá)爭(zhēng)論體外篩選HNE抑制劑使用的酶絕大局部是從人白細(xì)胞中提取獲得，由于提取本錢昂貴，得率不高，且血液制品缺乏平安性，迫切需要查找替代的酶生產(chǎn)方法。為了更快速、有效、大量的篩選HNE抑制劑，有人進(jìn)展了HNE全酶表達(dá)由于HNE對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁組分具有降解作用以及在T7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)中難以獲得有活性的HNE，酶完整cDNA克隆表達(dá)爭(zhēng)論承受了M13噬菌體系統(tǒng)。HNE的cDNA位于人白細(xì)胞株cDNA文庫中，由編碼8個(gè)氨基酸殘基的IL-2前導(dǎo)肽DNA以及238個(gè)氨基酸殘基的HNE前體DNA組成，以可溶性蛋白的形式表達(dá)，并可以通過賴氨酞肽酶切割獲得有活性的HNE。表達(dá)純化后所得HNE經(jīng)一系列酶活性檢測(cè)和與抑制劑反響的檢測(cè)，說明其性質(zhì)與自然HNE15μgHNE〔3～4天〕，與自然HNE提取方法相比并沒有多大優(yōu)勢(shì)〔每毫升全血中可得2.36μgHNE〕。1重組HNE和自然HNE與抑制劑的結(jié)合活性比較〔Tab1.TheparationofbiningactivitiesofrebinantHNEandnativeHNEwithinhibitors〕——————————————————————抑制率(%)(0.1g/L)———————————————重組HNE 自然HNE——————————————————————胰蛋白酶抑制劑 93 73α1-抗蛋白酶 78 47糜蛋白酶抑制劑 0 0——————————————————————酶催化構(gòu)造域表達(dá)MMPs外，承受催化構(gòu)造域單獨(dú)作用，還具有比全酶更高的穩(wěn)定性，可能是由于缺失了C端自我降解構(gòu)造的緣由。HNE催化構(gòu)造域〔Phe100-Gly263〕片段DNA是缺失前導(dǎo)構(gòu)造和血液結(jié)合素樣構(gòu)造的平頭末端蛋白DNA序列，以pGEMEX質(zhì)粒為載體，在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)過復(fù)性、提取純化后獲得的每升菌液可產(chǎn)生蛋白量約為23mg比自然蛋白酶提取法及全酶表達(dá)法的產(chǎn)率大大提高。蛋白幾乎全部存在于包含體中，經(jīng)上柱純化，并在Ca2+、Zn2+存在下