nrf2and通路在藥物治療中的作用

nrf2and通路在藥物治療中的作用

nf2是含有明亮氨基酸鏈基本結構的轉移因素，屬于cap-n-collar（cnc）調節(jié)蛋白家族。Nrf2及其信號通路與腫瘤、炎癥、糖尿病、慢性腎功能衰竭、哮喘、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)、神經系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等多種疾病病理生理和發(fā)病過程密切相關,已成為廣受關注的藥物靶點。Nrf2包括Neh1到Neh6共6部分結構。Neh1為堿性亮氨酸拉鏈基本序列,是Nrf2和Maf形成異二聚體并與抗氧化反應元件(anti-oxidantresponseelement,ARE)結合的區(qū)域。Nrf2與ARE結合的同時,由具有轉錄活性的Neh4和Neh5與輔助蛋白結合后才能啟動轉錄過程。Neh2能與Keap1結合并被其負性調節(jié),正常情況下胞漿中的Nrf2大多與Keap1結合而被降解。氧化應激、親電子試劑或磷酸化作用可導致Nrf2與Keap1解離和釋放;同時還可能減弱Keap1介導的蛋白酶對Nrf2的降解作用。Nrf2與Keap1解離后轉位進入細胞核,進而和ARE結合,啟動下游基因的轉錄。由此可以看出,通過阻止Nrf2與Keap1的結合、減弱Keap1介導的蛋白酶對Nrf2的降解作用都可以激活Nrf2/ARE通路。除此之外還可以通過調節(jié)Nrf2的核-漿穿梭或者誘導Nrf2的表達來調節(jié)Nrf2?，F(xiàn)有的Nrf2調節(jié)劑主要通過對Keap1的半胱氨酸殘基進行修飾來阻止Nrf2和Keap1的結合,調節(jié)Nrf2通路活性而達到治療疾病的目的。保護性基因包括Ⅱ相解毒酶基因、抗氧化蛋白類基因、泛素酶基因和蛋白酶體基因、以及多向性抗藥蛋白2(MRP2、ABCC2)基因等。研究表明Nrf2在抗腫瘤、抗凋亡、抗炎癥反應、抗動脈粥樣硬化、神經保護等方面發(fā)揮著重要作用。簡要介紹Nrf2/ARE通路在疾病發(fā)展中的作用及相關藥物研發(fā)的新進展。1nr2疾病的發(fā)展1.1nrf2是制病中的靶點,且爭議前發(fā)生階段仍發(fā)研究表明Nrf2/ARE通路參與了腫瘤的形成與發(fā)展。Yu等發(fā)現(xiàn)Nrf2基因敲除小鼠更易發(fā)生化學誘導的DNA損傷,在苯并芘致胃癌和亞硝基化合物致尿路上皮癌模型中表現(xiàn)出癌癥高發(fā)性。大量證據表明Nrf2是推動結腸直腸癌發(fā)生和進展的重要因素,以Nrf2/ARE通路為靶點可能是治療結腸直腸癌的有效途徑。此外,Nrf2基因缺陷的小鼠比野生型小鼠更易生成腫瘤,Nrf2誘導劑抑制腫瘤生長的研究結果進一步證明了Nrf2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關鍵作用。1.2nrf2對炎癥的保護作用炎癥反應是機體對抗外界感染和組織損傷的一種生理保護機制,但是炎癥反應紊亂又會造成眾多對機體有害的炎癥性疾病,如風濕、多發(fā)性硬化、銀屑病、炎性腸病等。最近研究發(fā)現(xiàn)Nrf2能調節(jié)促炎癥反應的刺激因素并能保護炎癥損傷的細胞和組織,在病理性炎癥反應中起到保護作用。Nrf2敲除小鼠發(fā)生類似狼瘡的多器官免疫損傷、血管內免疫復合物沉積、早期死于腎小球腎炎等多種改變,表明Nrf2在炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Nrf2誘導的下游靶基因HO-1是重要的抗炎酶,其抗炎機制被認為是增加一氧化碳水平和抑制巨噬細胞的活性。Nrf2本身能夠負性調節(jié)炎癥調節(jié)因子和酶類,如炎性細胞因子、炎癥趨化因子、細胞黏附分子、金屬蛋白酶、環(huán)氧合酶2(COX-2)等。Kim等已經詳細綜述了Nrf2與先天性和自身性免疫疾病、肺部炎癥、胃腸道炎癥、動脈粥樣硬化、腎炎、皮膚損傷、腦部炎癥等炎癥相關疾病發(fā)生發(fā)展的密切關系,因此Nrf2已成為研發(fā)治療以上疾病的重要靶點。1.3nrf2/在肌張血壓病作用下的病理組織學研究氧化應激是許多神經退行性疾病起始和發(fā)展的重要因素,有研究表明帕金森病和阿爾茨海默病等神經退行性疾病與還原型谷胱甘肽減少以及Ⅱ相解毒酶失調引起的氧化或過氧化有關。而Nrf2/ARE信號通路的神經保護作用已得到眾多的實驗驗證,Lee等認為Nrf2是通過拮抗線粒體復合物Ⅵ阻滯劑和提高細胞內鈣濃度來發(fā)揮神經保護功能的。Nrf2/ARE信號通路激動劑在肌萎縮側索硬化鼠模型上以及其他神經退行性疾病模型上表現(xiàn)出良好的治療潛力。對于急性神經系統(tǒng)疾病,如創(chuàng)傷性腦損傷、缺血性腦卒中、出血性腦卒中等,氧化應激是發(fā)病機制中非常重要的組成部分。有實驗證實在創(chuàng)傷性腦損傷時Nrf2及其調節(jié)的醌氧化還原酶(NQO1)等Ⅱ相解毒酶水平顯著增加,說明Nrf2/ARE信號通路是創(chuàng)傷性腦損傷時的內源性適應機制。而且一系列體內外實驗已經證實了Nrf2的神經保護作用,Nrf2信號通路誘導劑萊菔硫烷(sulforaphane)、姜黃素等也在實驗中表現(xiàn)出抗氧化應激、減少腦水腫和神經炎癥等功能。1.4高血壓的治療糖尿病時的高糖狀態(tài)所引起的氧化應激反應中產生的活性氧(ROS)在糖尿病急慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展上起關鍵作用。Nrf2/ARE信號通路作為參與氧化應激的關鍵通路之一,已有研究證實其與包括糖尿病腎病在內的多種病變密切相關。Tan等在心肌細胞的體內外實驗中發(fā)現(xiàn)糖尿病時能通過細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)下調Nrf2的功能,導致氧化應激,誘導胰島素抵抗,減少糖尿病患者心肌的葡萄糖利用。Xue等在高糖環(huán)境下培養(yǎng)微血管內皮細胞HMEC-1并用Nrf2的典型激動劑萊菔硫烷作用6~48h,結果表明萊菔硫烷能夠恢復高血糖引起的內皮細胞生物化學紊亂,提示Nrf2/ARE可以作為口服藥物研發(fā)的靶點。另外一項研究顯示Nrf2誘導劑奧體普拉可改善高脂飲食誘導的小鼠肥胖和胰島素抵抗,說明Nrf2抗氧化系統(tǒng)抵抗胰島素抵抗和肥胖的重要作用。用Nrf2基因敲除小鼠實驗的結果證實了Nrf2基因缺失會損害葡萄糖耐量并加重高血糖癥狀。2以nrf2為靶點的藥物設計由于Nrf2/ARE通路在糖尿病、神經性疾病、腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用,以Nrf2為靶點的藥物研發(fā)在各領域展開了廣泛的探索,其中治療糖尿病腎病的巴多克沙龍(bardoxolone)和治療多發(fā)性硬化的富馬酸二甲酯(dimethylfumarate)已進入了Ⅲ期臨床研究,有望誕生新藥。2.1巴多糖0.5%的糖尿病并發(fā)癥巴多克沙龍是一種合成的三萜類化合物,主要用于糖尿病腎病的治療。Dinkova-Kostova等發(fā)現(xiàn)巴多克沙龍能夠誘導Ⅱ相解毒酶(如NQO1)表達,抑制誘導型氮氧化物合酶(iNOS)的表達,這種作用在Nrf2-/-和keap1-/-的小鼠胚胎成纖維細胞中消失,證實其作用主要由Nrf2/ARE通路介導的。目前Reata制藥公司和雅培公司正在共同開展巴多克沙龍治療糖尿病腎病的大規(guī)模Ⅲ期臨床試驗。一項隨機、雙盲、安慰劑對照的多中心Ⅱ期臨床試驗中,270位糖尿病慢性腎病患者隨機接受安慰劑或巴多克沙龍治療(25、75、150mg,po,每日1次)共52周。結果顯示,給藥4周后巴多克沙龍各劑量組患者腎功能即有改善(腎小球濾過率升高),24周時25、75、150mg劑量組腎小球濾過率分別增加(8.2±1.5)、(11.4±1.5)、(10.4±1.5)mL/(min·1.73m2),明顯高于安慰劑對照組(P<0.001),且治療者腎小球濾過率(GRF)的升高一直持續(xù)至52周。另一個多中心的開放臨床試驗中,20位Ⅱ型糖尿病慢性腎病患者接受巴多克沙龍25mg/d治療28d,隨后加大劑量至75mg/d,56d時90%患者的GRF增加伴隨血肌酐和血尿素氮減少,并顯示出劑量和時間相關,說明巴多克沙龍治療能明顯改善糖尿病患者的腎功能。研究者和雅培制藥公司稱這種藥物“有可能極大地改變慢性腎病的治療狀況、改善患者的預后”。2.2模擬檢測生物標志物的活性和生物利用度從十字花科植物綠花椰菜提取的萊菔硫烷是一種Ⅱ相酶誘導劑,可以預防多種化學致癌物誘導的DNA損傷和腫瘤的發(fā)生。綠花椰菜中富含蘿卜硫苷(glucoraphanin),后者經水解形成萊菔硫烷。在細胞和動物實驗中,萊菔硫烷已經表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性,主要作用機制是激活Nrf2信號通路,誘導Ⅱ相酶(NQO1、谷胱甘肽巰基轉移酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、葡萄糖醛酸基轉移酶等)的表達。Ding等給野生型和Nrf2-/-小鼠ig萊菔硫烷0、10、40μmol/kg,共5d,隨后ip給予4-苯基苯胺(ABP),24h后處死動物,收集膀胱檢測dG-C8-ABP和Nrf2調節(jié)的細胞保護基因。結果野生型小鼠萊菔硫烷對dG-C8-ABP的阻止效率是61%,在Nrf2-/-小鼠中完全無作用;在野生型小鼠膀胱上皮細胞中能檢測到顯著的NQO1,Nrf2-/-小鼠中則檢測不到;這就證明萊菔硫烷能阻止ABP引起的膀胱細胞和組織的DNA損傷,其作用主要由Nrf2介導。Kensle等進行了萊菔硫烷激活Nrf2/ARE信號通路及其安全性、藥動學、生物利用度和藥效學等實驗。其中一項優(yōu)化劑量處方的安慰劑對照試驗招募了291名志愿者,給予試驗者富含萊菔硫烷40μmol和富含蘿卜硫苷6mmol的混合物,3個月后評價綠花椰菜芽飲料對空氣污染生物標志物的影響以及萊菔硫烷的耐受性和有效性。但是該試驗結果至今還沒有公布。2.3動星狀細胞的nrf2/au通路富馬酸二甲酯(BG-12)是治療多發(fā)性硬化癥的口服藥,作用機制包括抑制NF-κB、促進活化T淋巴細胞的凋亡、增加細胞因子IL-4和IL-5、激動Nrf2增加NQO1、HO-1以及谷胱甘肽的水平等。Lin等用20μmol富馬酸二甲酯和溶媒處理星狀細胞,結果富馬酸二甲酯組細胞核中檢測到的Nrf2水平比對照組高,研究者認為富馬酸二甲酯激動星狀細胞的Nrf2/ARE通路,提高谷胱甘肽的表達,從而發(fā)揮對膠質細胞及其鄰近神經元的保護作用。Scannevin等用富馬酸二甲酯或富馬酸單甲酯處理動物或者神經細胞都能增加細胞核內Nrf2的水平,然而這個現(xiàn)象在Nrf2基因敲除小鼠中消失。新藥BG-12已經進入臨床試驗階段,一個Ⅲ期臨床試驗(DEFINE)是隨機雙盲、安慰劑對照、劑量比較研究,旨在確定其治療復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化患者的有效性和安全性。1200多名患者隨機接受安慰劑或BG-12治療,每日2次或每日3次,po,每次240mg,共2年。結果2年后服用BG-12每日2次、每日3次組及安慰劑組的復發(fā)率分別為27%、26%、46%(P<0.001);每日2次、每日3次BG-12組比安慰劑對照組的年復發(fā)率分別減少53%、48%(P<0.001),確認的殘疾進展分別減少38%(P=0.005)、34%(P=0.01)。另一項CONFIRM研究驗證了DEFINE研究的結果,BG-12可顯著降低年復發(fā)率,用藥2年時,服用BG-12每日2次、每日3次組分別比安慰劑組的年復發(fā)率低44%(