中國極地微生物的研究進(jìn)展

中國極地微生物的研究進(jìn)展苑孟中國極地微生物學(xué)考察研究簡史

從1981年起,中國微生物學(xué)家即涉足南極,并于1987年發(fā)表了第一篇論文(Nichuzhietal.,1987),即《ThehetertrophicmicrobesindryVictorialandandRossIslandAntarctica》；1984年之前,中國學(xué)者曾參與南大洋水體的細(xì)菌和生物量考察,并發(fā)表過數(shù)篇論文；從1984年起,中國開始獨(dú)立組隊(duì)進(jìn)行南極考察,中國海洋微生物學(xué)家參加了相關(guān)的考察活動；上世紀(jì)末,我們進(jìn)行了中國首次北極考察,微生物研究涉足北極地區(qū)(50年代吳寶鈴先生曾隨前蘇聯(lián)學(xué)者赴北極作過考察),并發(fā)表過論文；中國南北極微生物考察研究的成果為掌握極地微生物的基本狀況,及研究全球變化對該特定生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的影響奠定了初步基礎(chǔ)；本世紀(jì)初,中國學(xué)者又開始關(guān)注世界第三極—青藏高原的微生物及其環(huán)境狀況。（一）類別目前中國所取得的南極微生物主要類別見表2。中國極地微生物調(diào)查研究主要成果

由該表可見,研究的微生物以細(xì)菌為主,次為菌物(即真菌)。不完全統(tǒng)計(jì)表明所研究的細(xì)菌大約有38屬(種),絲狀菌物6屬,酵母8屬(種),此外尚有腸系細(xì)菌。不同功能類型的微生物包括固氮細(xì)菌、硝化細(xì)菌、石油烴降解菌、耐重金屬菌、耐LPS菌、耐酸菌及衛(wèi)生狀況指示菌等等。南極微生物的優(yōu)勢菌群：α、β-變性細(xì)菌群，噬纖維菌-黃桿菌-擬桿菌群（CFBgroup）。（二）極地生態(tài)環(huán)境與環(huán)境微生物學(xué)的研究這方面的研究主要將微生物置于整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中分析,如南極磷蝦集群過程、集群區(qū)及磷蝦本身的微生物學(xué)研究，,在潮間帶生態(tài)系統(tǒng)、食物鏈中的作用,菲爾德斯半島及附近區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性、生態(tài)結(jié)構(gòu)特征、食物鏈及與生物/非生物因子間關(guān)系分析(吳寶鈴等,1998)。（三）極地微生物的開發(fā)利用研究1、抗凍物質(zhì)冷適應(yīng)微生物最顯著的特征便是具有相對低的代謝速率，在長期的生物進(jìn)化過程中形成了一系列的適應(yīng)低溫的機(jī)制。這些機(jī)制包括營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA的復(fù)制合成、蛋白質(zhì)的合成、合成代謝和分解代謝的正常進(jìn)行、能量代謝的正常進(jìn)行、細(xì)胞的分裂等。2、多不飽和脂肪酸(PolyUnsaturatedFattyAcids，PUFA)具有廣泛而重要的生物功能，這已經(jīng)被越來越多的人所認(rèn)識。然而隨著PUFA開發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)大，來自于植物、哺乳動物和海洋魚的PUFA遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，微生物特別是藻類、真菌能合成幾乎所有的PUFA并能在工業(yè)規(guī)模上培育而被視為有開發(fā)價(jià)值的可替代的生物資源。在南極細(xì)菌中具有多聚不飽和脂肪酸(PUEA)生成能力的細(xì)菌所占比例高于其在溫帶海洋細(xì)菌中的比例。3、抗紫外輻射物質(zhì)在南極上空的臭氧層最薄時(shí)厚度僅為平時(shí)的50%，并出現(xiàn)了臭氧空洞，從而使UV一B總輻照度的比例增加uv一B對藻類傷害的主要目標(biāo)是藻細(xì)胞中分子中的蛋白質(zhì)、色素、DNA等，抑制光合作用、生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。為了避免或減少UV輻射，生活在高輻射環(huán)境下的生物體形成了許多物理的或者化學(xué)的保護(hù)機(jī)制。Scytonemin、MAAs是兩類抗輻射的物質(zhì)，如果提取這種化合物、了解其吸收紫外線的機(jī)理，有望將其作為防止紫外線的保護(hù)劑應(yīng)用到化妝品中。類胡蘿卜素在保護(hù)細(xì)胞和生物體免受光、氣體和感光色素等損傷中起重要作用。4、低溫酶低溫酶的低溫催化能力，低熱穩(wěn)定性使其在工業(yè)應(yīng)用上有以下的優(yōu)勢:通過溫和的熱處理使低溫酶失活，快速而經(jīng)濟(jì)地終止反應(yīng);生產(chǎn)過程在低溫或室溫下進(jìn)行，無需加熱和冷卻，可以降低成本;生產(chǎn)過程便于監(jiān)控。5、抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)據(jù)統(tǒng)計(jì)，人們己經(jīng)從微生物中發(fā)現(xiàn)了8000多種具有抗菌和抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物。然而，從陸生微生物中新發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)的種類正在減少，并且大部分是己知的化合物。另一方面，越來越多的傳染性病菌對傳統(tǒng)抗生素逐漸產(chǎn)生了抗藥性，威脅人類健康的三大疾病之一的癌癥也難以找到有效的治療藥物，從而迫使生物學(xué)家尋找新的天然生物活性物質(zhì)來解決目前面臨的問題。因此，極地微生物由于具有獨(dú)特的生理機(jī)制而成為最有希望為人類提供產(chǎn)生具有生物活性的新化合物的微生物資源寶庫之一傳統(tǒng)的環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究方法采用計(jì)數(shù)、微生物培養(yǎng)及鑒定，生理生化分析等手段進(jìn)行，這些方法在很大程度上依賴于微生物的培養(yǎng)和純種分離技術(shù)。純培養(yǎng)很難，尤其是在南北極這樣的極端環(huán)境中?，F(xiàn)有研究認(rèn)為在自然界中僅有0.001%一1%的微生物能夠用現(xiàn)有的技術(shù)手段進(jìn)行人工培養(yǎng)。而且經(jīng)過平板培養(yǎng)微生物有機(jī)體還有可能會偏離原來自然種群的生理習(xí)性，甚至有可能偏離它們原來的基因型組合。隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使我們不必培養(yǎng)微生物，而直接通過對環(huán)境中的遺傳物質(zhì)的研究來達(dá)到目的，也為從分子水平上開展較為全面的、無偏差的微生物生態(tài)學(xué)研究開辟了新的途徑。極端環(huán)境微生物分子研究方法及進(jìn)展（一）從自然樣品中直接提取核酸：從環(huán)境樣品中提取核酸的方法可分為兩類，一是轉(zhuǎn)移后裂解法，即先將微生物菌體與土壤顆粒分開，再提取DNA。另一類是直接裂解法，即在土壤中直接裂解微生物菌體后提取DNA。相比之下，直接裂解法可以提取出沉積物樣品中近乎所有的微生物種群，且DNA產(chǎn)量大。在高效裂解細(xì)胞的同時(shí)對己釋放出的DNA不予破壞是提高DNA產(chǎn)出率的決定因素。目前己報(bào)道的裂解法有碾磨法、超聲波裂解法、液氮凍融法、變性劑熱裂解法、酶解法等。需要提取DNA的方法（二）分子生物學(xué)分析1.DNA熔解(解鏈)及復(fù)性分析該方法可應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的分析。通過測定整個(gè)群落的堿基組成和DNA的復(fù)雜性可估計(jì)出總的群落遺傳結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜性。分析DNA的熔解曲線可以得到堿基組成的于G+C%。在限定條件下，測定溶液中剪切的或熱失活DNA的復(fù)性動力學(xué)可以測定DNA序列的復(fù)雜性。2.質(zhì)粒指紋圖譜分析:質(zhì)粒的大小和數(shù)目隨物種的不同有所差異。質(zhì)粒數(shù)是相對穩(wěn)定的,它可用來區(qū)分同一物種的不同菌株。3.低分子量RNA分布圖這種方法為tRNA(75-90%個(gè)核苷酸)和5SrRNA(105-120個(gè)核苷酸)的雙相電泳分離。4.結(jié)合PCR的一些技術(shù)：克隆文庫分析法限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP)變性梯度凝膠電泳(DGGE)或者溫度梯度凝膠電泳(TGGE)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)將兩種以上的上述的分子生物學(xué)方法結(jié)合運(yùn)用。①克隆文庫分析法主要步驟包括：(1)樣品中總DNA的提?。?2)建立16SrRNA基因克隆文庫；(3)以限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切篩選文庫；(4)測序；(5)序列的比較分析。②變性梯度凝膠電泳(DGGE)或者溫度梯度凝膠電泳(TGGE)在含有連續(xù)變性劑梯度或者連續(xù)溫度梯度的凝膠中，加入雙鏈的PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不同G+C含量的DNA組分在凝膠中的移動速度的不同，直接反映DNA的多態(tài)性。低G+C含量的組分在凝膠中變性較快，在凝膠中的移動速度較慢，高G+C含量的DNA在凝膠中變性較慢，在凝膠中的移動速度快，從而使不同DNA在凝膠中的位置不同，產(chǎn)生不同的帶。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究中，包括微生物群落多樣性研究、環(huán)境變化對微生物群落影響的研究比較不同微環(huán)境微生物群落差異等。《南極中山站沉積物中微生物多樣性分析及宏基因組文庫研究》1.南極沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)查：DNA的提取純化、PCR擴(kuò)增、DGGE、序列測定和系統(tǒng)計(jì)劃關(guān)系分析。2.南極中山站排污入海口沉積物中微生物宏基因組文庫的構(gòu)建和研究：沉積物中總DNA的提取、大片段目的DNA的篩選和回收、插入DNA片段末端補(bǔ)平、連接、體外包裝。cosmid宏基因組文庫的保存和陽性克隆的篩選、宏基因組文庫評估、宏基因組文庫中抗菌活性物質(zhì)篩選、宏基因組文庫中抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選、宏基因組文庫中酶活篩選?！侗睒O深海沉積物中細(xì)菌多樣性研究》對溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法等5種方法提取北極深海沉積物宏基因組DNA進(jìn)行了比較;并對沉積物宏基因組中16SrDNA基因PCR擴(kuò)增相關(guān)的引物序列、引物濃度、退火溫度和模板稀釋度等條件，以及PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE)的聚丙烯酞胺凝膠濃度、變性劑濃度梯度進(jìn)行了優(yōu)化。1.溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法1mLTENP緩沖液(50mMTris，pH8.0，20mMEDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP)等5種方法提取北極深海沉積物宏基因組DNA。2.沉積物宏基因組DNA純化（腐殖酸是土壤DNA提取過程中極難去除的污染物，在PCR擴(kuò)增時(shí)，極少量的腐殖酸，就會抑制DNA聚合酶的活性，干擾擴(kuò)增結(jié)果）①電泳切膠回收②PEG8000純化在上述粗提沉積物DNA溶液中加入20μL的4M的NaCl溶液與80μL13%PEG8000溶液(w/v)，冰浴放置30min;10000r/min離心15mim收集沉淀;用70%的酒精洗沉淀后11000r/min離心l0min;用滅菌的濾紙條