成骨細胞的數(shù)量對體外鈣化結(jié)節(jié)形成的影響

成骨細胞的數(shù)量對體外鈣化結(jié)節(jié)形成的影響【摘要】目的了解體外培養(yǎng)成骨細胞的接種數(shù)量對鈣化結(jié)節(jié)形成的影響。方法實驗選用了1×105個/ml、2×105個/ml、5×105個/ml三個不同的細胞接種濃度，并且每個濃度組分別給予含β-甘油磷酸鈉和維生素C的條件培養(yǎng)液以及常規(guī)培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)。顯微鏡觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成，并做鈣化結(jié)節(jié)染色。結(jié)果在培養(yǎng)30天內(nèi)，條件培養(yǎng)液或常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)的5×105個/ml組細胞無結(jié)節(jié)形成；而2×105個/ml組和1×105個/ml組都有鈣化結(jié)節(jié)形成，而且有細胞越少形成結(jié)節(jié)越早，數(shù)量越多的趨勢；給予條件培養(yǎng)液又較常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)有結(jié)節(jié)形成早而多的趨勢。鈣化結(jié)節(jié)染色顯示結(jié)節(jié)為紅色。結(jié)論體外培養(yǎng)成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)的形成須接種適宜的細胞數(shù)量，用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞能促進鈣化結(jié)節(jié)形成。

【關(guān)鍵詞】成骨細胞；鈣化結(jié)節(jié)；體外培養(yǎng)

Observationofculturedosteoblastsformingmineralizationnodesinvitro

【Abstract】ObjectiveToinvestigatewhetherosteoblastsculturedinvitrocanformmineralizationnodes.MethodTheosteoblastsat1×105/ml,2×105/mland5×105/mlcelldensitywereculturedintheDMEMmediumandintheDMEMmediumsupplementedwithβ-glycerophosphatesodiumandascorbicacid.Theformationprocessofmineralizationnodeswereobservedwithmicroscopeandcalcifiednodulesstainwasmade.ResultsThereweremoremineralizationnodestoforminshortertimeinthe1×105/mlcelldensitygroupcomparedwithinthe2×105/mlcelldensitygroup,butinthe5×105/mlcelldensitygroup,therewerenot,andwiththeDMEMmediumcontainedβ-glycerophosphatesodiumandascorbicacid,mineralizationnodesformedmoreearlycomparedwiththeDMEMmedium.MineralizationnodesstainshowedCulturedosteoblastsatsuitablecelldensitycaneasilyformmineralizationnodesinvitro,andβ-glycerophosphatesodiumandascorbicacidjustpromoteformationofmineralizationnodes.

【Keywords】osteoblast;mineralizationnodes;invitro

隨著成骨細胞體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，其體外培養(yǎng)成為骨組織工程及骨替代材料研究的一種重要手段。成骨細胞的體外鈣化對提取的成骨細胞鑒定及其在材料表面的生物學(xué)效應(yīng)的研究尤為重要，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)成骨細胞的接種數(shù)量對其鈣化有影響,而國內(nèi)外文獻未見關(guān)于這方面的報道。因此，有必要對成骨細胞體外鈣化形成條件作以報道，為骨替代材料的研究提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

材料與主要試劑日本大耳白幼兔，出生10～15天，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。常規(guī)DMEM培養(yǎng)液內(nèi)含DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素。條件DMEM培養(yǎng)液為常規(guī)DMEM培養(yǎng)液中補加10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50μg/ml維生素C。

兔成骨細胞體外分離與培養(yǎng)以幼兔的顱蓋骨為材料，采用組織塊法［1］分離提取原代成骨細胞，置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至100％融合后，進行傳代培養(yǎng)并反復(fù)純化。

鈣化結(jié)節(jié)標本制備取第六代成骨細胞接種于置有蓋玻片的六孔板內(nèi),按細胞濃度為1×105/ml、2×105/ml、5×105/ml設(shè)為A、B、C組，每組又分兩組，即A1、A2、B1、B2、C1、C2組，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，A1、B1、C1組換條件培養(yǎng)液，而A2、B2、C2組仍為等體積的常規(guī)培養(yǎng)液。各組每3天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)30天，顯微鏡觀察鈣化結(jié)節(jié)形成過程。

茜素紅染色鏡下可見黑色不透明區(qū)域時行茜素紅染色，取出蓋玻片，PBS沖洗后，95%乙醇固定10min，%茜素紅染色30min，蒸餾水沖洗,甘油明膠封片。

2結(jié)果

鈣化結(jié)節(jié)形成：細胞連續(xù)培養(yǎng)30天，A1、A2、B1、B2組都在不同的時間內(nèi)出現(xiàn)了肉眼可見的白色結(jié)節(jié)，顯微鏡下呈現(xiàn)黑色，隨著培養(yǎng)時間的延長，結(jié)節(jié)數(shù)量逐漸增多；而C1、C2組培養(yǎng)30天無結(jié)節(jié)形成。A1組約18天左右有結(jié)節(jié)形成；A2組和B1組約在23天左右可見有結(jié)節(jié)形成；B2組結(jié)節(jié)形成最晚約30天。觀察還發(fā)現(xiàn)1×105個/ml組與2×105個/ml組相比較，前者較后者有結(jié)節(jié)數(shù)量多的趨勢；同一細胞接種濃度給予條件培養(yǎng)液培養(yǎng)又較常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)有結(jié)節(jié)形成多的趨勢。各組在鏡下觀察有結(jié)節(jié)形成時行茜素紅染色,結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色。

3討論

普遍認為體外培養(yǎng)成骨細胞經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)后可形成鈣化結(jié)節(jié)。鈣化結(jié)節(jié)的形成過程大致經(jīng)過成骨細胞快速增殖期、細胞外基質(zhì)成熟期、基質(zhì)礦化期3個生長階段。只有成骨細胞進入成熟期，才預(yù)示鈣化發(fā)生［1～4］。本實驗經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)成骨細胞不經(jīng)傳代,連續(xù)培養(yǎng)會停止增殖而進入下一期,但由于成骨細胞的接種數(shù)量不同,在礦化期顯示出差異,細胞接種數(shù)量越多，鈣化結(jié)節(jié)形成越少甚至無各組細胞在有結(jié)節(jié)形成時茜素紅染色顯示出明顯的紅色結(jié)節(jié)，而無結(jié)節(jié)部位的細胞為淺紅色。說明各組細胞表面都有含鈣基質(zhì)，可見細胞具有較高分泌ALP的活性。堿性磷酸酶的表達，被認為是細胞外基質(zhì)成熟期的早期標志［1］。因而說明無結(jié)節(jié)部位的細胞已進入分化期，但未達成熟?？赡苤挥屑毎植烤奂纬杉毎麍F，才能為鈣化結(jié)節(jié)的形成打下基礎(chǔ),同時成骨細胞之間才能相互促進成熟，胞體變小，轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌毎?并隨著鈣化基質(zhì)的增多而逐漸被埋入其內(nèi),最終形成明顯的鈣化結(jié)節(jié)。而細胞接種數(shù)量越多，經(jīng)細胞增殖期后細胞就越多，這可能影響了細胞團的形成，導(dǎo)致細胞進入成熟期的時間延長,最終在一定的時間內(nèi)形成的鈣化結(jié)節(jié)越少甚至無。從鈣化的主要機理可知，條件培養(yǎng)基中的β-甘油磷酸鈉能為細胞提供磷酸根成分，促進生理鈣鹽沉積；維生素C可促進體外成骨細胞合成Ⅰ型膠原，以及膠原纖維的羥化［5］。因此，用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細胞能為鈣化提供物質(zhì)基礎(chǔ)，因而促進鈣化較早發(fā)生,且結(jié)節(jié)形成也會較用常規(guī)培養(yǎng)液多。因此，體外培養(yǎng)成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)的形成與成骨細胞的數(shù)量有關(guān)。濃度太低，會影響細胞間的聯(lián)系，從而影響細胞的生長增殖；濃度太高，細胞增殖太多，鈣化不易發(fā)生。在有關(guān)成骨細胞鈣化的研究中要注意成骨細胞的接種數(shù)量。

【參考文獻】

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