基因工程-第9章-外源基因的表達1

第九章外源基因的表達基因表達(geneexpression)就是指某一基因指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)合成，蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物?？寺』虮磉_方面的研究成果，對于某些研究領(lǐng)域有著重要的用途。首先，它有可能為揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供新的研究手段。例如，運用重組DNA技術(shù)，能夠獲得可在大腸桿菌細胞中進行有效表達的雜種干擾素的編碼基因。這樣，便可以將這種蛋白質(zhì)分子純化出來，在體外進行生物學(xué)方面的研究。

利用基因工程技術(shù)將真核基因轉(zhuǎn)至原核生物中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用傳統(tǒng)和常規(guī)方法不能或難以大量生產(chǎn)的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”來生產(chǎn)就方便得多。例如生長激素釋放抑制因子從50萬只羊腦中僅能提取出5mg，而現(xiàn)在用10L的工程菌液即能提出來。用720kg豬胰臟只能夠提取出100mg胰島素，而用2000L工程菌發(fā)酵液即可得到同樣量的胰島素。從這些例子中可以看到基因工程在應(yīng)用方面的巨大潛力。

9.1外源基因在原核細胞中的表達9.1.1原核生物基因表達的特點同所有的生命過程一樣，外源基因在原核細胞中的表達包括兩個主要過程：即DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA和mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。與真核細胞相比，原核細胞的表達有以下特點：①原核生物只有一種RNA聚合酶(真核細胞有三種)識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成。②原核生物的表達是以操縱子為單位的。操縱子是數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)的結(jié)合，是一個基因表達的協(xié)同單位。調(diào)控區(qū)主要分為三個部分：操縱子(operator)、啟動子(promotor)及其他有調(diào)控功能的部位。

③由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進行的。原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，轉(zhuǎn)錄成mRNA后，可直接在胞漿中與核糖體結(jié)合翻譯形成蛋白質(zhì)。④原核基因一般不含有內(nèi)含子(intron)，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。⑤原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。對RNA合成的控制有兩種方式，一是起始控制(啟動子控制)，二是終止控制(衰減子控制)。⑥在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16S核糖體RNA3’末端堿基互補的序列，即S-D序列，而真核基因則缺乏此序列。欲將外源基因在原核細胞中表達，必須考慮表達載體、外源基因的性質(zhì)、原核細胞的啟動子和S-D序列、閱讀框架及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，也就是說必須滿足以下條件：①通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；②外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA(genomicDNA)；③必須利用原核細胞的強啟動子和S-D序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達；④外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(openreadingframe)；⑤利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達，防止外源基因的表達產(chǎn)物對宿主菌的毒害。

9.1.2基因表達的調(diào)控序列如上所述，由于原核和真核細胞中基因表達的機制是不同的，因此必須詳細了解基因表達過程中的各種調(diào)控因子，構(gòu)建高效的表達載體，才能達到高效率、高水平表達外源基因的目的。對原核生物來講，基因表達的調(diào)控序列主要涉及啟動子、S-D序列、終止子、衰減子等序列。1.啟動子

啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。原核生物啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游5～10bp，一般由6～8個堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或—10區(qū)。啟動子來源不同，Pribnow盒的堿基順序稍有變化。-35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處，故稱-35區(qū)，一般由10個堿基組成。一般認(rèn)為，-35區(qū)是RNA聚合酶σ亞基的識別與結(jié)合位點。當(dāng)σ亞基附著在-35區(qū)后，便帶動RNA聚合酶的核心酶(coreenzyme，無σ亞基的RNA聚合酶)沿DNA鏈向轉(zhuǎn)錄起始方向滑動至Pribnow盒，并與之接觸，而一旦它們相互結(jié)合之后，σ亞基就從最左邊的識別位點上解離下來。

(1)lac啟動子lac啟動子是來自大腸桿菌的乳糖操縱子。lac操縱子模型最初由Jacob和Monod于1961年提出，它是DNA分子上一段有方向的核苷酸順序，即由阻遏蛋白基因，(lacI)、啟動基因(啟動子P)、操縱基因(O)和編碼3個與乳糖利用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)基因所組成(圖8-2)。(2)trp啟動子trp啟動子可從大腸桿菌的色氨酸操縱子中分離。色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因排列及其表達如圖8-3所示。

(3)PL和PR啟動子PL和PR啟動子是指從λ噬菌體中得到的一類啟動子，它比lac啟動子活性高8-10倍。λ噬菌體有自己的一套阻遏物-操縱基因系統(tǒng)(圖8-4)。(4)tac啟動子tac啟動子是一組由非常強的trp和lac啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子。它比lacUV5啟動子強7倍。其中tacI是由trp啟動子的-35和lacUV5的-10區(qū)構(gòu)成；tacⅡ是由trp啟動子的-35區(qū)加上一個合成的46bpDNA片段(包括Pribnow盒區(qū))和lac基因所構(gòu)成；tacl2是由trp的-35區(qū)和lac的-10區(qū)，再加上lac操縱子中的操縱基因部分和S-D序列融合而成的，它受1ac阻遏蛋白的負調(diào)控，并被IPTG誘導(dǎo)。

2．S-D序列mRNA在細菌中的轉(zhuǎn)譯效率依賴于是否有核糖體結(jié)合位點的存在，即S-D序列以及S-D序列與起始密碼子AUG之間的距離。在原核細胞中，當(dāng)mRNA結(jié)合到核糖體上后，翻譯或多或少會自動發(fā)生。細菌在翻譯水平上的調(diào)控是不嚴(yán)格的，只有RNA和核糖體的結(jié)合才是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3-10bp處的由3-9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16SrRNA3’末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點。根據(jù)發(fā)現(xiàn)者的名字，命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱S-D序列。3．終止子在一個基因的3’端或是一個操縱子的3’端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：①RNA聚合酶停留在DNA模板上不再前進，RNA的延伸也停止在終止信號上；②完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來；③RNA聚合酶從模板上釋放出來。對RNA聚合酶起終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G／C的區(qū)域，G／C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)，這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且具有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。4．衰減子

衰減子(attenuator)是指在某些前導(dǎo)序列中帶有控制蛋白質(zhì)合成速率的調(diào)節(jié)區(qū)。在原核生物中，一條mRNA分子常常編碼數(shù)種不同的多肽鏈。這種多順反子mRNA的頭一條多肽鏈合成的起始點，同RNA分子的5’-P末端間的距離可達數(shù)百個核苷酸。這段位于編碼區(qū)之前的不轉(zhuǎn)譯的mRNA區(qū)段，叫做前導(dǎo)序列(1eader)。此外，在mRNA的3'-OH末端，以及在多順反子mRNA中含有的長達數(shù)百個堿基的順反子間序列(intercistranic-sequence)，即間隔序列(spacer)，也發(fā)現(xiàn)有不轉(zhuǎn)譯的序列。

9.1.3幾種類型的原核表達載體非融合蛋白：不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達蛋白稱為非融合蛋白。非融合蛋白的優(yōu)點在于它具有非常接近于真核細胞體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此表達產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。非融合蛋白的最大缺點是容易被細菌蛋白酶所破壞。融合蛋白：融合蛋白是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質(zhì)由一條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。含原核細胞多肽的融合蛋白是避免細菌蛋白酶破壞的最好措施?；蚬こ痰妮d體有克隆載體和表達載體之分。克隆載體中都有一個松弛型復(fù)制子，能帶動外源基因在受體細胞中復(fù)制擴增。表達載體是適合在受體細胞中表達外源基因的載體。1.非融合型表達蛋白載體pKK223-3這個載體是由Brosius等在哈佛大學(xué)的Gilbert實驗室組建的。在大腸桿菌細胞中，它能極有效地高水平表達外源基因。它具有一個強的tac(trp-lac)啟動子。這個啟動于是由trp啟動子的-35區(qū)、lacUV5啟動子的-10區(qū)、操縱基因及S-D序列組成。在lacI宿主(如JMl05)，tac啟動子受阻遏，但只要在適當(dāng)?shù)臅r候加上IPTG，就可去阻遏。如圖8-7所示，緊接tac啟動子的是一個取自pUC8的多位點接頭(polylinker)，使之很容易把目的基因定位在啟動子和S-D序列后。在多位點下游的一段DNA序列中，還包含一個很強的rrnB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子，目的是為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)。因為上游強的tac啟動子控制的轉(zhuǎn)錄必須由強終止子抑制，才不至于