斑馬魚卵抑素對(duì)骨骼肌增殖的調(diào)控作用

斑馬魚卵抑素對(duì)骨骼肌增殖的調(diào)控作用

根據(jù)以往的研究，racemy是一個(gè)激生長(zhǎng)因子超基因家族的成員。正如其他遺傳因素超基因家族的成員一樣，rax7信號(hào)分子的調(diào)節(jié)可以抑制肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)和成年階段的肌肉組織的生長(zhǎng)。正如其他遺傳因素超基因家族的成員一樣，racemat活性物質(zhì)的第一合成出現(xiàn)在信號(hào)遺傳、前體功能物質(zhì)和c-c活動(dòng)物質(zhì)的形式中。前體分子通過(guò)兩次蛋白質(zhì)水處理工藝形成具有生物活性的抗凝劑分子。在水解活動(dòng)開始之前，抗凝劑前體可以以非公共或私人價(jià)格組合形成二聚體，前體分子也可以通過(guò)親水糖合物二聚體形成非活性二聚體，以抑制抗健素和受體的結(jié)合。根據(jù)研究，danioremote的抗腫脹性肌腱與其他高等動(dòng)物相似，但也會(huì)抑制肌肉骨骼的生長(zhǎng)。卵泡抑素(follistatin,Fst)是一種分泌性的糖蛋白具有和激活素受體ⅡB亞基(activinreceptorⅡBActRⅡB)強(qiáng)烈的親和作用.Fst也具有與部分轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子成員直接結(jié)合的能力,被認(rèn)為是一些轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超基因家族成員信號(hào)分子的有效阻抑蛋白分子.一般認(rèn)為,其直接與多數(shù)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超基因家族成員信號(hào)分子結(jié)合的能力較弱于其與激活素(activin)的結(jié)合力[6~8].據(jù)報(bào)道,Fst可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而阻抑生長(zhǎng)分化因子-11(growthdifferentiationfactor-11,GDF-11)和抑肌素的活性.其基因敲除后的新生突變小鼠顯示出肌肉量顯著下降的表型,而在肌肉組織中高表達(dá)Fst的小鼠與野生型小鼠相比,出現(xiàn)因肌肉細(xì)胞增殖和細(xì)胞個(gè)體增大所導(dǎo)致的骨骼肌總量明顯增長(zhǎng).最近研究發(fā)現(xiàn),鯉科魚類斑馬魚中存在著兩種Fst基因,Fst1和Fst2.其中,Fst1是一種存在于所有硬骨魚類的Fst種類,同源性分析表明它與其他高等脊椎動(dòng)物的Fst更為相似.在斑馬魚的早期胚胎發(fā)育階段,Fst1最早的表達(dá)出現(xiàn)在新生的體節(jié)外緣層細(xì)胞中,Fst1強(qiáng)烈表達(dá)于體節(jié)腹面和側(cè)面區(qū)域,而該區(qū)域是魚類骨骼肌和鰭條肌主要肌肉前體細(xì)胞集中區(qū)域,暗示Fst1與鯉科魚類的肌肉生成發(fā)育過(guò)程相關(guān).考慮到在小鼠肌肉組織中高表達(dá)Fst蛋白可以有效地阻止生長(zhǎng)分化因子(包括抑肌素),利用斑馬魚骨骼肌特異的肌球蛋白輕鏈(myosin,lightpolypeptide2,skeletalmuscle,mylz2)基因的啟動(dòng)子構(gòu)建了肌肉特異性高表達(dá)Fst1的斑馬魚轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒,并通過(guò)顯微注射及轉(zhuǎn)基因篩選,獲得了在肌肉組織中穩(wěn)定高表達(dá)Fst1的斑馬魚穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系.該轉(zhuǎn)基因品系的魚體體重僅發(fā)生小量增加,但本研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)在肌肉組織中特異性高表達(dá)Fst1可以導(dǎo)致成年斑馬魚肌肉組織中重要成肌因子myoD和pax7基因的增強(qiáng)表達(dá).而且通過(guò)組織切片觀察發(fā)現(xiàn),肌纖維數(shù)量的顯著增加可導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因品系肌肉組織增生.本研究提示,鯉科魚類組織中的Fst具有與哺乳動(dòng)物類似的對(duì)抑肌素的負(fù)調(diào)控作用.1材料和方法1.1斑馬魚fst1的結(jié)構(gòu)表達(dá)斑馬魚mylz2:EGFP轉(zhuǎn)基因載體由新加坡國(guó)立大學(xué)宮知遠(yuǎn)博士提供.Tol2增強(qiáng)子誘捕質(zhì)粒由新加坡國(guó)立分子與細(xì)胞研究所VladimirKorzh博士提供.正向引物(5′-GGATCCACCATGTACCCATACGAT-GTTCCAGATTACGCT-3′)和反向引物(5′-GGATCC-TTTATTGCAGCTTATAATGGTT-3′),均含BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn),采用PCR擴(kuò)增從pCMV-HA質(zhì)粒(Clontech,PT3285,829~1049bp)獲得一個(gè)含有多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)和SV40轉(zhuǎn)錄結(jié)束的多腺苷酸尾序列.擴(kuò)增片段經(jīng)BamHⅠ酶切后,克隆進(jìn)mylz2:EGFP載體,從而獲得肌肉特異性表達(dá)的中間載體.隨后,通過(guò)XbaⅠ酶切與Klenow酶的堿基補(bǔ)平和自連反應(yīng),將該中間載體的XbaⅠ位點(diǎn)破壞.利用已在引物設(shè)計(jì)中加入了XbaⅠ酶切位點(diǎn)的正向引物(5′-AATTCGCCACAGAGGAATG-3′)和反向引物(5′-TTTATTGCAGCTTATAATGGTT-3′)將含有mylz2啟動(dòng)子、MCS和SVSV40轉(zhuǎn)錄結(jié)束的多腺苷酸尾序列的DNA片段由該中間載體中擴(kuò)增出來(lái).通過(guò)XbaⅠ酶切,克隆進(jìn)Tol2增強(qiáng)子誘捕質(zhì)粒后,獲得擁有肌肉特異性表達(dá)的mylz啟動(dòng)子、供目的基因插入的多基因克隆位點(diǎn),以及一個(gè)由斑馬魚皮膚角質(zhì)蛋白8(keratin8)啟動(dòng)子基本元件調(diào)控的熒光蛋白EGFP表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體.以基因庫(kù)中存在的斑馬魚卵泡抑素1(Fst1)的基因序列(登錄號(hào):NM_131037)為依據(jù),設(shè)計(jì)一對(duì)含有EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn)的正向引物(5′-AT-GAATTCGGATGCTAAGGATGCTAAAGCG-3′)和含有XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)的反向引物(5′-ATCTCGAGCTAC-TTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGCGCACACAG-CTTCCTCCG-3′).通過(guò)RT-PCR技術(shù)從斑馬魚胚胎期的總RNA提取物中擴(kuò)增出斑馬魚卵泡抑素(Fst1)的全長(zhǎng)0.9kb片段,并通過(guò)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切方式將該擴(kuò)增出的斑馬魚Fst1全長(zhǎng)片段克隆入前述的肌肉組織特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體中.斑馬魚Fst1表達(dá)將由斑馬魚肌肉組織特異、高效表達(dá)mylz2的啟動(dòng)子調(diào)控.同一載體中由斑馬魚keratine8啟動(dòng)子調(diào)控的在斑馬魚表皮細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白的單元將可作為轉(zhuǎn)基因的篩選標(biāo)記(圖1(A)).位于這些功能性表達(dá)調(diào)控單元兩側(cè)的Tol2轉(zhuǎn)座子臂將提高功能性表達(dá)調(diào)控單元整合到斑馬魚基因組的效率.1.2斑馬魚fst1的表達(dá)及純化青鳉(Oryziaslatipes)的轉(zhuǎn)座酶編碼DNA克隆由V.Korzh博士提供.10ng的Fst1轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒DNA和25ng的體外合成轉(zhuǎn)座酶mRNA顯微注射入1~2細(xì)胞期的斑馬魚魚卵,具體過(guò)程按照Parinov等人所描述方法.使用Leica熒光體視顯微鏡對(duì)注射后魚卵中熒光蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行觀察.通過(guò)對(duì)斑馬魚表皮細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白的情況,對(duì)穩(wěn)定發(fā)生轉(zhuǎn)基因的品系進(jìn)行初篩,為獲得具有穩(wěn)定遺傳特征的轉(zhuǎn)基因F1代魚,對(duì)每尾在皮膚中表達(dá)有熒光的F0代與野生型親本交配,觀察其子代各100粒受精卵.對(duì)F1中皮膚表達(dá)熒光的魚做進(jìn)一步Fst1原位雜交實(shí)驗(yàn),證實(shí)Fst1基因在肌肉組織中高量表達(dá),從而獲得轉(zhuǎn)基因魚的穩(wěn)定遺傳品系,并反溯出其轉(zhuǎn)基因品系的原始F0代魚.同時(shí)采用針對(duì)基因組DNA的PCR方法檢查轉(zhuǎn)基因片段的整合.以斑馬魚與基因組DNA為模板,通過(guò)正向引物(位于mylz2啟動(dòng)子區(qū)域)5′-TCAGTGGCTACAGCTCATTCA-3′和反向引物(位于斑馬魚Fst1編碼區(qū)域)5′-TTTGTCTG-GTCCACCACGCAA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增,預(yù)期的整合片段長(zhǎng)度為981bp.這些穩(wěn)定遺傳的F0代魚與野生型的交配后代中Fst1高表達(dá)陽(yáng)性魚(轉(zhuǎn)基因遺傳雜合子)作為后續(xù)研究材料.1.3na多聚酶抑制劑fst1的合成采用由地高辛標(biāo)記(digoxigenin,DIG)的RNA探針開展原位雜交分析,其詳細(xì)操作步驟按Li等人所述.將斑馬魚Fst1cDNA序列克隆至pBluescript載體,經(jīng)過(guò)BamHⅠ酶切線性化后,由T7RNA多聚酶合成Fst1反義RNA探針.以經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛溶液固定的各發(fā)育時(shí)期至5dpf(daypostfertilization)發(fā)育階段的幼苗作為原位雜交材料.雜交緩沖液成分:50%甲酰胺,5倍SSC緩沖液(1倍緩沖液成分為15mmol/LNaCl和15mmol/L檸檬酸鈉,pH7.6),50mg/mL肝素,50mg/mLtRNA和0.1%吐溫),70℃雜交,后與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體孵育,加入硝基四氮唑(nitrobluephosphate,NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(5-bromo,4-chloro,3-indolilphosphate,BCIP)顯色.1.4斑馬魚fst1,fst1的熒光定量pcrfst1,fst1的合成采用實(shí)時(shí)PCR對(duì)處在60dpf階段的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蒸~和高表達(dá)Fst1轉(zhuǎn)基因魚肌肉組織中的Fst1、成肌因子myoD,pax7的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè).具體操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行.使用Trizol溶液(Invitrogen)從約100mg的斑馬魚肌肉組織中提取總RNA.隨后,采用不含RNA酶的DNA水解酶去除提取的總RNA樣品中可能混雜的DNA.單鏈cDNA由SuperScript?Ⅲplatinum?One-stepqRT-PCR試劑盒(Invitrogen)中的反轉(zhuǎn)錄酶合成.隨后,將利用設(shè)計(jì)的特異性正向、反向引物對(duì)Fst1,myoD和pax7進(jìn)行擴(kuò)增(引物序列見表1),以斑馬魚持家基因β-肌動(dòng)蛋白(actin)作為內(nèi)參,對(duì)所擴(kuò)增出的斑馬魚片段進(jìn)行定量分析,并對(duì)所有擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序鑒定.使用SequenceDetector(PRISM7700;ABI,FosterCity,CA,USA)開展熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè).每個(gè)反應(yīng)體積為2μLcDNA和終濃度為2ng/μL的引物,樣品最初加熱至50℃保溫2min,然后95℃保溫10min,PCR反應(yīng):95℃保溫15s,60℃保溫1min,共40個(gè)循環(huán).采用SDSv1.7a分析軟件確定每個(gè)樣品中的檢測(cè)閾值和最小檢測(cè)循環(huán)次數(shù).1.5橫截肌肉組織石蠟包埋、切片在30和60dpf階段,對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蒸~稱重.對(duì)于肌肉組織學(xué)分析,分別采取10尾非轉(zhuǎn)基因和穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因F1的60dpf階段的魚體橫截肌肉組織,用Bouin’s溶液固定10h,再按照常規(guī)石蠟包埋、切片程序,經(jīng)常規(guī)的伊紅/美藍(lán)(Haematoxilin/Eosin)染色,測(cè)算背鰭前端斷面組織切片指定區(qū)域中的肌纖維數(shù).2結(jié)果2.1宏觀表達(dá)特征檢測(cè)將經(jīng)BglⅡ酶切線性化的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶共注射入1~2細(xì)胞期的斑馬魚受精卵后,75%注射后受精卵在孵化期內(nèi)顯示出異常的發(fā)育缺陷,并導(dǎo)致胚胎死亡.這可能是由于在胚胎發(fā)育階段Fst1的錯(cuò)誤表達(dá)所致.典型的Fst1注射后F0代受精卵的表型特征如圖1(C)所示,以a,b,c標(biāo)記胚胎.180粒注射后的受精卵中仍有約45尾魚存活至成年期(圖1(D)和(E)).由于轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)架中含有表皮表達(dá)熒光蛋白的調(diào)控原件,因此可以通過(guò)對(duì)注射后的魚卵以及F1代魚苗的表皮細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白特性進(jìn)行觀察(圖1(B)和(E)),從而便于對(duì)肌肉組織中高表達(dá)Fst1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因魚品系的篩選.共觀察到28尾F0代斑馬魚具有表皮熒光表達(dá)特征,其中有3尾被證實(shí)為有表皮細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)的F1代轉(zhuǎn)基因魚.通過(guò)對(duì)F1代基因組DNA的PCR檢測(cè),也證實(shí)有轉(zhuǎn)基因片段的插入(圖1(G)).這些穩(wěn)定遺傳的魚作為F0代與野生型交配,產(chǎn)生F1代轉(zhuǎn)基因魚用以研究,F0~F1的陽(yáng)性遺傳率介于3%~7%(圖1(F)).不同于最初構(gòu)建Fst1高表達(dá)轉(zhuǎn)基因F0代顯微注射的情況,肌肉組織中高表達(dá)Fst1的F1代轉(zhuǎn)基因魚與非轉(zhuǎn)基因同胞個(gè)體一樣,均未觀察到其胚胎期發(fā)育的顯著異常(圖1(E)和(F)).隨后通過(guò)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng),證實(shí)了在60dpf階段3株獨(dú)立遺傳轉(zhuǎn)基因品系的肌肉組織中都對(duì)應(yīng)于其對(duì)照轉(zhuǎn)基因陰性同胞個(gè)體具有較高的Fst1表達(dá),其中轉(zhuǎn)基因品系2或3具有相當(dāng)于其非轉(zhuǎn)基因個(gè)體6倍的表達(dá)水平(圖1(H)).2.2fpsd的比較對(duì)魚齡為30和60dpf,分別來(lái)自同一父母本的轉(zhuǎn)基因魚和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蒸~進(jìn)行體重稱量.在日齡30天時(shí),轉(zhuǎn)基因魚與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蒸~在體重上并未表現(xiàn)出顯著差異.然而,在日齡達(dá)到60天時(shí),Fst1的F1代雜合子魚體較其非轉(zhuǎn)基因姊妹有8.14%的平均體重增加(表1).與抑肌素相關(guān)基因的研究相比,前人報(bào)道的在肌肉中高表達(dá)抑肌素前體突變蛋白的斑馬魚純合子相對(duì)于其非轉(zhuǎn)基因姊妹體重增加(10%~15%),但其雜合子轉(zhuǎn)基因斑馬魚卻未表現(xiàn)出任何體重的增加.雖然未進(jìn)行針對(duì)Fst1轉(zhuǎn)基因純合子斑馬魚的觀察,但本實(shí)驗(yàn)中Fst1的F1代雜合子已經(jīng)表現(xiàn)出體重的增加,說(shuō)明肌肉中高效表達(dá)Fst1具有比抑肌素前體突變蛋白更強(qiáng)的促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的作用.2.3fst1/pax7對(duì)fst1基因突變斑馬魚肌肉組織的影響為觀察肌肉組織中高表達(dá)Fst1對(duì)重要的肌肉生長(zhǎng)調(diào)控基因的影響,采用整體原位雜交技術(shù)對(duì)胚胎期的轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行了myoD基因表達(dá)觀察.結(jié)果未發(fā)現(xiàn)Fst1轉(zhuǎn)基因魚在胚胎期的myoD表達(dá)與非轉(zhuǎn)基因魚有顯著不同(數(shù)據(jù)未顯示).但采用實(shí)時(shí)PCR分析技術(shù)對(duì)日齡60天的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因魚的肌肉組織中myoD的表達(dá)量進(jìn)行觀察,卻發(fā)現(xiàn)在成年的Fst1轉(zhuǎn)基因魚肌肉組織中myoD的表達(dá)量較非轉(zhuǎn)基因姊妹魚有顯著增高(圖2).與myoD類似,成肌因子pax7在肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和分化中起關(guān)鍵的促進(jìn)作用.通過(guò)對(duì)Fst1轉(zhuǎn)基因斑馬魚肌肉組織中表達(dá)的pax7檢測(cè),發(fā)現(xiàn)60dpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的pax7表達(dá)水平較非轉(zhuǎn)基因同胞有明顯的增高(圖2).以上結(jié)果表明,肌肉組織中高表達(dá)Fst1可以促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)活動(dòng).2.4fst1轉(zhuǎn)魚的肌纖維計(jì)數(shù)和含量為了觀察Fst1轉(zhuǎn)基因高表達(dá)是否會(huì)影響斑馬魚肌肉生長(zhǎng),取60日齡的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因姊妹群的典型樣本對(duì)其對(duì)等區(qū)域的肌肉組織進(jìn)行組織學(xué)觀察,以測(cè)定肌纖維數(shù)量和肌纖維橫截面面積(圖3).測(cè)定了在相同放大倍數(shù)下轉(zhuǎn)基因魚和非轉(zhuǎn)基因姊妹成魚位于背鰭第一鰭條基部的截面相應(yīng)區(qū)域的肌纖維數(shù)量(圖3(C)~(G)),記錄到在Fst1轉(zhuǎn)基因魚肌肉組織的相應(yīng)區(qū)域平均具有更多的肌纖維數(shù)(轉(zhuǎn)基因組:604.14±47.76,n=10;非轉(zhuǎn)基因組:462.63±32.12,n=10).觀察到,Fst1轉(zhuǎn)基因魚肌肉組織相同區(qū)域中存在著更多的肌纖維,因而其相應(yīng)的肌纖維平均具有的截面也較非轉(zhuǎn)基因姊妹魚小(圖3(D)~(G)),表明未發(fā)生肌纖維細(xì)胞的體積增大.以上結(jié)果表明,Fst1的高表達(dá)主要以肌纖維增殖(hyperplasia)而非肌纖維增大(hypertrophy)的方式促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng).3結(jié)構(gòu)方程模型中基因td1的表達(dá)對(duì)肌肉組織生長(zhǎng)和肌肉組織體重的影響本研究采用斑馬魚肌肉特異性高表達(dá)mylz2啟動(dòng)子對(duì)Fst1在肌肉組織中的增強(qiáng)表達(dá),來(lái)觀察高表達(dá)Fst1對(duì)魚類肌肉生長(zhǎng)可能具有的調(diào)控作用.起初的轉(zhuǎn)基因載體注射使大量受精卵(75%)發(fā)生明顯的發(fā)育缺陷,可能是由于Fst1對(duì)斑馬魚原腸期發(fā)育階段的背腹軸決定過(guò)程中所起的關(guān)鍵作用所致.但尚有少數(shù)(25%)注射魚受精卵得以存活并在其基因組中成功攜帶了mylz:Fst1的表達(dá)調(diào)控單元.這部分受精卵的存活可能得益于mylz啟動(dòng)子的肌肉表達(dá)特異性以及其在胚胎階段表達(dá)較晚的特性.本結(jié)果表明,在肌肉組織中高效表達(dá)Fst1可以顯著地增強(qiáng)重要的成肌因子myoD和pax7在肌肉中的表達(dá)(圖2),促進(jìn)肌纖維細(xì)胞的增殖,并以此方式促進(jìn)斑馬魚的肌肉生長(zhǎng)(圖3).抑肌素是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超基因家族中的主要肌肉生長(zhǎng)調(diào)控因子.在哺乳動(dòng)物中,缺少抑肌素基因的純合子突變體表現(xiàn)為肌肉總量的顯著增加.先前的研究也表明,通過(guò)RNA干擾和morpholino注射技術(shù)等對(duì)胚胎期的斑馬魚抑肌素功能的抑制可以導(dǎo)致斑馬魚在胚胎發(fā)育期的重要成肌基因的高表達(dá)并出現(xiàn)魚體的大型化.可是,本研究與前期在斑馬魚中開展的另一項(xiàng)有關(guān)抑肌素前體突變蛋白肌肉高效表達(dá)轉(zhuǎn)基因工作相似,均未能在斑馬魚胚胎期至2周齡前的斑馬魚早期發(fā)育過(guò)程中觀察到成肌因子myoD和myf5的增高表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示),也未觀察到在斑馬魚早期發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)肌肉增長(zhǎng)的表型(表2).但本研究中的mylz2:Fst1轉(zhuǎn)基因斑馬魚,與過(guò)去高表達(dá)Fst1轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)的表型相似.成年階段的轉(zhuǎn)基因斑馬魚與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蒸~相比顯示出肌肉生長(zhǎng)增強(qiáng)的特征,表明在魚類肌肉組織中轉(zhuǎn)基因高表達(dá)Fst1具有對(duì)肌肉組織生長(zhǎng)的促進(jìn)作用.在魚體重量性狀方面,獲得的mylz2:Fst1轉(zhuǎn)基因魚,也與前人通過(guò)顯微注射抑肌素干擾性RNA導(dǎo)致斑馬魚在幼苗期的大型化現(xiàn)象的觀察不同.本實(shí)驗(yàn)觀察到雜合子Fst1轉(zhuǎn)基因魚在早期階段,其體重與非轉(zhuǎn)基因魚并未顯示出明顯差異,而僅在成魚階段的轉(zhuǎn)基因魚體重有小量增加(表2).本實(shí)驗(yàn)采用的是在肌肉組織中高表達(dá)Fst1,其效應(yīng)可能僅集中于肌肉組織中抑肌素功能的抑制,而抑肌素RNA注射方式則實(shí)際是對(duì)全身性抑肌素作用的抑制.本實(shí)驗(yàn)中,由于僅在肌肉組織中高表達(dá)Fst1,所以僅在轉(zhuǎn)基因魚肌肉組織中提供了對(duì)抑肌素活性的阻抑作用,而未影響抑肌素在魚體其他組織中的潛在作用.從而使得本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因魚未在幼年期就發(fā)生明顯的體重增加,而是僅在成年期轉(zhuǎn)基因斑馬魚肌肉組織發(fā)生增生,其表型較早期全身性抑肌素RNA干擾方式所產(chǎn)生的體重增加的表型相對(duì)溫和.此外,也可能因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中,Fst1的表達(dá)由于受mylz2啟動(dòng)子調(diào)控,其表達(dá)起始于20hpf,而不同于顯微注射方式,在胚胎發(fā)育的更早期就可能顯現(xiàn)出抑制效果.Lee和McPherron,Zhu等人通過(guò)對(duì)小鼠肌肉組織中高表達(dá)抑肌素相關(guān)蛋白的觀察,發(fā)現(xiàn)在肌肉組織中高表達(dá)Fst相對(duì)于高表達(dá)抑肌素前體突變蛋白,Fst基因的高表達(dá)具有更強(qiáng)的對(duì)肌肉組織生長(zhǎng)的促進(jìn)作用.值得注意的是,對(duì)高表達(dá)Fst1轉(zhuǎn)基因斑馬魚成年階段肌肉組織的成肌基因的表達(dá)、肌肉組織的增生以及體重的增加等特性的分析,與在斑馬魚肌肉組織中高表達(dá)抑肌素前體突變蛋白的觀察結(jié)論對(duì)比,也得出相同的結(jié)論.其原因可能是在肌肉組織中高表達(dá)抑肌素前體突變蛋白將僅能抑制體內(nèi)野生型抑肌素分子對(duì)肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控作用,而認(rèn)為Fst1除了可以抑制抑肌素的功能外,還可能對(duì)其他轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超基因家族成員(如生長(zhǎng)分化因子-11等)潛在的對(duì)肌肉組織生長(zhǎng)的抑制作用發(fā)生阻抑效果從而使其在肌肉組織中高表達(dá)Fst1,具有比抑肌素前體突變蛋白高表達(dá)更明顯的效果.本研究發(fā)現(xiàn),在成年mylz2:Fst1轉(zhuǎn)基因斑馬魚肌肉組織中可以觀察到成肌因子myoD的增強(qiáng)表達(dá),而該現(xiàn)象并未在抑肌素前體突變蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚中被觀察到同時(shí),與在肌肉組織中高表達(dá)抑肌素前體突變蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚相比,在肌肉組織中高表達(dá)Fst1對(duì)肌纖維的增殖更為明顯.這些都可能反映出Fst1具有比抑肌素前體突變蛋白更強(qiáng)的促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的能力,而該能力的獲得可能是由于Fst1對(duì)除抑肌素外的其他轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超基因家族成員的功能抑制.抑肌素基因的缺失可以導(dǎo)致