配合飼料中磺胺類藥物的測定高效液相色譜法

ICSDB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/Txxxx—xxxx高效液相色譜法DeterminationofsulfonamidesinformulafeedsHigh—performanceliquidchromatography（報(bào)批稿）（本稿完成日期：2008年2月）200X-XX-XX發(fā)布200200X-XX-XX發(fā)布浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省海洋與漁業(yè)局水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)委員會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省海洋與漁業(yè)局水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：寧波市海洋與漁業(yè)研究院、臺州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊家鋒、段青源、程巖雄、鐘惠英、卓華龍、朱勵(lì)華、鄭丹。飼料中磺胺類藥物的測定，已有一份國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T19542-2007《飼料中磺胺類藥物的測定一高效液相色譜法》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中磺胺嘧啶,磺胺二甲基嘧啶,磺胺間甲氧嘧啶,磺胺甲噁唑,磺胺喹噁啉等5種磺胺類藥物的測定方法。與該標(biāo)準(zhǔn)相比，本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測的藥物品種更廣。當(dāng)需要對飼料中磺胺嘧啶,磺胺二甲基嘧啶,磺胺間甲氧嘧啶,磺胺甲噁唑,磺胺喹噁啉含量進(jìn)行仲裁檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)優(yōu)先依據(jù)GB/T19542一2007進(jìn)行。配合飼料中磺胺類藥物的測定高效液相色譜法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了配合飼料中磺胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉等15種磺胺類藥物的高效液相色譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料中磺胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基異噁唑、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺異噁唑、磺胺二甲氧噠嗪、磺胺喹噁啉15種磺胺類藥物含量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法原理試樣中磺胺類藥物用乙腈—氯仿溶液提取，正己烷除雜質(zhì)，經(jīng)液—液萃取，濃縮，微孔濾膜過濾后，用反相色譜柱分離，紫外檢測器檢測，外標(biāo)法定量。試劑與材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水符合GB/T6682中二級水的規(guī)定。4.1乙酸。乙腈：色譜純。甲醇：色譜純。氯仿。4.5正己烷。無水硫酸鈉。20%甲醇溶液：取20mL甲醇用水溶解并稀釋至100mL。乙腈-氯仿混合溶液（10+1，v/v）。乙腈-氯仿混合溶液（1+2，v/v）。10%硫酸鈉溶液：稱取10g無水硫酸鈉，用水溶解并稀釋至100mL。2%硫酸鈉溶液：稱取2g無水硫酸鈉，用水溶解并稀釋至100mL。1%乙酸溶液：乙酸-水（1+99，v/v），pH=3.0?；前奉愃幬飿?biāo)準(zhǔn)品：純度大于98%?；前?，磺胺嘧啶，磺胺噻唑，磺胺吡啶，磺胺甲基嘧啶，磺胺5-甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯噠嗪，磺胺甲基異噁唑，磺胺6-甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺異噁唑，磺胺二甲氧噠嗪，磺胺喹噁啉?；前奉愃幬飿?biāo)準(zhǔn)溶液4.14.1磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取15種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品各100.0mg,分別放入100mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋定容至刻度，搖勻。該溶液中15種磺胺類藥物濃度均為1.00mg/mL。置4oC冰箱中保存（保存期不超過3個(gè)月）。4.14.2磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別移取15種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4.14.1）各1.00mL于100mL棕色容量瓶中，用20%甲醇（4.7）稀釋定容，即得混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。該標(biāo)準(zhǔn)溶液含各種磺胺濃度均為10.0卩g/mL，置4oC冰箱中保存（保存期不超過1周）。4.14.3磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.14.2），用20%甲醇（4.7）稀釋定容至1.0mL,即得混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。該混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中含每種磺胺濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0卩g/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。儀器與設(shè)備高效液相色譜儀配備紫外檢測器。分析天平：感量為0.0001g。均質(zhì)器。高速離心機(jī)：8000r/min。氮吹儀。旋渦混合器。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。聚四氟乙烯離心管：15mL。容量瓶：100mL。玻璃雞心瓶：100mL。5.11聚四氟乙烯濾膜，孔徑0.45pm。分析步驟試樣制備采集具有代表性的飼料樣品至少2kg，四分法縮減至250g,粉碎，過40目分析篩，混勻，裝入密閉容器中，避光室溫保存，備用。提取6.2.1脂肪含量不高的試樣：準(zhǔn)確稱取試樣1g（精確到0.001g），放入15mL離心管內(nèi)，依次加入0.5mL10%硫酸鈉溶液（4.10）和5mL乙腈-氯仿混合溶液（4.8），于旋渦混合器上劇烈混勻，4000r/min離心10min,將上層清液轉(zhuǎn)入玻璃雞心瓶內(nèi)。再依次用5mL乙腈-氯仿混合溶液（4.8）重復(fù)提取殘?jiān)?，合并提取液于玻璃雞心瓶中。6.2.1高脂肪含量試樣：準(zhǔn)確稱取試樣1g（精確到0.001g），加入5g堿性氧化鋁外，按6.2.1操作。凈化將提取液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，低于40oC蒸發(fā)至近干，向殘?jiān)屑尤?mL2%硫酸鈉溶液（4.11）和5mL正已烷（4.5）,于旋渦混合器上劇烈混勻，使殘?jiān)芙?，溶液轉(zhuǎn)入離心管中，4000r/min離心5min,用吸管移去正已烷層。若雜質(zhì)較多，再用5mL正已烷萃取水相一次，離心，棄去正己烷層。萃取、濃縮水相中加入5mL乙腈-氯仿混合溶液（4.9）,在旋渦混合器上劇烈混勻，4000r/min離心5min。用吸管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，再用2mL乙腈-氯仿混合溶液（4.9）重復(fù)操作，合并提取液，氮?dú)獯蹈?。用甲醇溶液?.7）溶解殘?jiān)?，并定容?mL，8000r/min離心10min,過0.45pm微孔濾膜后，供高效液相色譜測定。高效液相色譜測定6.5.1高效液相色譜條件色譜柱：ODSC4.6mmX250mm,填料粒度為5pm,或性能相當(dāng)者。柱溫：40*。流速：0.8ml/min。進(jìn)樣量：20pLo檢測波長：285nm。流動(dòng)相：A乙腈，B甲醇，C1%乙酸；流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1o表1流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間（time）A(%)B(%)C(%)0559015588745101575602025556555906.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作以色譜條件（6.5.1）測定混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.14.3），以磺胺類藥物各組分測得結(jié)果的峰面積或峰高為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試液測定以上述色譜條件（6.5.1）測定試液，記錄相應(yīng)的色譜峰峰面積或峰高，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得試液中各種磺胺類藥物濃度。15種磺胺類藥物保留時(shí)間參見附錄Ao空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按分析步驟進(jìn)行。結(jié)果計(jì)算與表述試樣中磺胺類藥物的含量按公式（1）計(jì)算：x= （1）m式中：X.---試樣中每種磺胺類藥物殘留量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C廠-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查的試樣液中每種磺胺類藥物濃度，單位為微克每毫升（卩g/mL）；V---試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；m---稱取的試樣重量，單位為克（g）o注：計(jì)算結(jié)果需將空白值扣除。平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。方法回收率、定量限和重復(fù)性本方法添加濃度在0.5?10mg/kg時(shí)，15種磺胺類藥物回收率參見附錄B；15種磺胺類藥物的定量限均為0.5mg/kg；兩個(gè)平行測定的結(jié)果相對偏差不得大于15%。

附錄A

（資料性附錄）0102030405060min附錄A

（資料性附錄）0102030405060min15種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖1 磺胺（5.21min）2一一磺胺嘧啶（12.50min）3一一磺胺噻唑（15.60min）4一一磺胺吡啶（17.49min）5一一磺胺甲基嘧啶（19.79min）6一一磺胺5-甲氧嘧啶（27.74min）7——磺胺二甲基嘧啶（28.55min） 磺胺甲氧噠嗪（31.70min） 磺胺氯噠嗪（37.61min） 磺胺甲基異噁唑（39.58min）11——磺胺6-甲氧嘧啶（42.02min）12磺胺多辛（43.50min）13——磺胺異噁唑（48.17min）14 磺胺二甲氧噠嗪（58.79min）15——磺胺喹噁啉（59.97min）附錄B

（資料性附錄）15種磺胺類藥物方法回收率本方法添加濃度在0.5?10mg/kg時(shí)，15種磺胺類藥物回收率分別為:磺胺73.8%?90.8%磺胺嘧啶77.4%?98.1%磺胺噻唑75.7%?92.4%磺胺吡啶71.9%?95.4%磺胺甲基嘧啶86.8%?105.1%磺胺5-甲氧嘧啶72.2%?